Fiche technique

Description biologique

Spécificité	Cox1 Antibody [N11K4] détecte les niveaux endogènes de la protéine Cox1 totale.
Contexte	La cyclooxygénase-1 (COX-1), également connue sous le nom de prostaglandine G/H synthase 1 (PTGS1), est une enzyme liée à la membrane, dépendante de l'hème, appartenant à la famille des cyclooxygénases, qui catalyse la conversion de l'acide arachidonique en prostaglandine H2, une étape pivotale dans la biosynthèse des prostanoïdes. La COX-1 est un homodimère comprenant trois domaines principaux par sous-unité : un domaine de facteur de croissance épidermique, un domaine de liaison membranaire et un domaine catalytique qui contient à la fois des sites actifs de cyclooxygénase et de peroxydase, s'intégrant dans un seul feuillet de la bicouche lipidique avec l'hème comme cofacteur. L'activité cyclooxygénase de l'enzyme oxygène l'acide arachidonique pour former le PGG2, qui est ensuite réduit en PGH2 par sa fonction peroxydase, initiant la synthèse des prostaglandines et des thromboxanes, molécules essentielles à la régulation de l'inflammation, de l'agrégation plaquettaire et de l'homéostasie vasculaire. La COX-1 est exprimée de manière constitutive dans la plupart des tissus, jouant un rôle clé dans le maintien de l'intégrité de la muqueuse gastrique, du flux sanguin rénal et de la fonction plaquettaire dans des conditions physiologiques normales. Son activité est modulée par les niveaux de peroxyde lipidique, et elle présente une régulation allostérique négative unique à de faibles concentrations d'arachidonate, permettant un réglage précis de la synthèse des prostanoïdes. La COX-1 est également inhibée de manière irréversible par les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) tels que l'aspirine, qui modifie un résidu de sérine près du site actif pour empêcher la formation de thromboxane A2, réduisant l'agrégation plaquettaire et l'inflammation.

Spécificité

Cox1 Antibody [N11K4] détecte les niveaux endogènes de la protéine Cox1 totale.

Contexte

La cyclooxygénase-1 (COX-1), également connue sous le nom de prostaglandine G/H synthase 1 (PTGS1), est une enzyme liée à la membrane, dépendante de l'hème, appartenant à la famille des cyclooxygénases, qui catalyse la conversion de l'acide arachidonique en prostaglandine H2, une étape pivotale dans la biosynthèse des prostanoïdes. La COX-1 est un homodimère comprenant trois domaines principaux par sous-unité : un domaine de facteur de croissance épidermique, un domaine de liaison membranaire et un domaine catalytique qui contient à la fois des sites actifs de cyclooxygénase et de peroxydase, s'intégrant dans un seul feuillet de la bicouche lipidique avec l'hème comme cofacteur. L'activité cyclooxygénase de l'enzyme oxygène l'acide arachidonique pour former le PGG2, qui est ensuite réduit en PGH2 par sa fonction peroxydase, initiant la synthèse des prostaglandines et des thromboxanes, molécules essentielles à la régulation de l'inflammation, de l'agrégation plaquettaire et de l'homéostasie vasculaire. La COX-1 est exprimée de manière constitutive dans la plupart des tissus, jouant un rôle clé dans le maintien de l'intégrité de la muqueuse gastrique, du flux sanguin rénal et de la fonction plaquettaire dans des conditions physiologiques normales. Son activité est modulée par les niveaux de peroxyde lipidique, et elle présente une régulation allostérique négative unique à de faibles concentrations d'arachidonate, permettant un réglage précis de la synthèse des prostanoïdes. La COX-1 est également inhibée de manière irréversible par les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) tels que l'aspirine, qui modifie un résidu de sérine près du site actif pour empêcher la formation de thromboxane A2, réduisant l'agrégation plaquettaire et l'inflammation.

Informations dutilisation

Application

WB, IP

Dilution

WB	IP
1:1000	1:50

Réactivité

Human, Mouse

Source

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

70 kDa

Tampon de stockage

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

Stockage
(À partir de la date de réception)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

Méthodes expérimentales
WB	Experimental Protocol: Sample preparation 1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature. 2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant; 5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration; 6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice. Electrophoretic separation 1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 10%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations 2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.) Transfer membrane 1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter; 2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer; 3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip"; 4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 120 min. ( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.) Block 1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes; 2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature; 3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time. Antibody incubation 1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:1000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight; 2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time; 3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour; 4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time. Antibody staining 1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly; 2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Méthodes expérimentales

WB

Experimental Protocol:

Sample preparation

1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature.

2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant;

5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration;

6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice.

Electrophoretic separation

1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 10%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations

2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.)

Transfer membrane

1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter;

2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer;

3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip";

4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications

Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 120 min.

( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.)

Block

1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes;

2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature;

3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time.

Antibody incubation

1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:1000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight;

2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time;

3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour;

4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time.

Antibody staining

1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly;

2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Références

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12432914/
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11597987/

Données dapplication

WB

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Lane 1: C2C12, Lane 2: Hela