UNC1999

Les tests d'activité de la méthyltransférase sont effectués en surveillant l'incorporation d'un groupe méthyle tritié provenant de la S-adénosylméthionine (3H-SAM) dans des substrats peptidiques biotinylés à l'aide du Scintillation Proximity Assay (SPA) pour le complexe trimérique PRC2-EZH2 (EZH2:EED:SUZ12), le complexe pentamérique PRC2-EZH1 (EZH1:EED:SUZ12:RBBP4:AEBP2), SETD7, G9a, GLP, SETDB1, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, SUV39H2, le complexe tétramérique MLL1 (MLL:WDR5:RbBP5:ASH2L), PRMT1, PRMT3, le complexe PRMT5-MEP50 et SMYD2. Le tampon de réaction pour SMYD2 et SMYD3 est 50 mM Tris pH 9.0, 5 mM DTT, 0.01% TritonX-100 ; pour G9a, GLP et SUV39H2 est 25 mM phosphate de potassium pH 8.0, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl₂ et 0.01% Triton X-100 ; et pour les autres HMT 20 mM Tris pH 8.0, 5 mM DTT, 0.01% TritonX-100. Pour arrêter les réactions enzymatiques, 10 μL de 7.5 M chlorhydrate de guanidine sont ajoutés, suivis de 180 μL de tampon, mélangés et transférés dans une FlashPlate à 384 puits. Après mélange, les mélanges réactionnels sont incubés et les comptes CPM sont mesurés à l'aide d'un lecteur de plaques Topcount. Les comptes CPM en l'absence de ce composé pour chaque ensemble de données sont définis comme 100% d'activité. En l'absence de l'enzyme, les comptes CPM dans chaque ensemble de données sont définis comme le bruit de fond (0%). Les valeurs d'IC50 sont déterminées en utilisant des concentrations de composé allant de 100 nM à 100 μM. Les valeurs d'IC50 sont déterminées à l'aide du logiciel SigmaPlot. Les essais EZH2-Y641F sont effectués en utilisant 30 nM d'enzyme dans 20 mM Tris pH 8, 5 mM DTT, 0.01% Triton X-100, 5 μM SAM et 1 μM de peptide H3 (1-24) (identique à celui du complexe PRC2-EZH2 de type sauvage). Pour DNMT1, l'essai est effectué en utilisant de l'ADN double brin hémi-méthylé comme substrat. Le substrat d'ADN double brin est préparé par recuit de deux brins complémentaires (brin sens biotinylé : BGAGCCCGTAAGCCCGTTCAGGTCG et brin antisens : CGACCTGAACGGGCTTACGGGCTC), synthétisés par Eurofins MWG Operon. Le tampon de réaction est 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM DTT, 0.01% Triton X-100. Les essais d'activité méthyltransférase pour DOT1L sont effectués à l'aide de plaques filtrantes. Les mélanges réactionnels dans 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM DTT, 2 mM MgCl₂ et 0.01% Triton X-100 sont incubés à température ambiante pendant 1h, 100 μL de TCA à 10% sont ajoutés, mélangés et transférés sur une plaque filtrante. Les plaques sont centrifugées à 2000 tr/min pendant 2 min, suivies de 2 lavages supplémentaires avec du TCA à 10% et un lavage à l'éthanol (180 μL) suivi d'une centrifugation. Les plaques sont séchées et 100 μL de MicroO sont ajoutés et centrifugés. 70 μL de MicroO sont ajoutés et les CPM sont mesurés à l'aide d'un lecteur de plaques Topcount.

DLBCL cell line harboring the EZH2Y641N mutant

~5 μM

8 days

DB cells, a diffuse-large B-cell lymphoma cell line harboring the EZH2 Y641N mutation, are obtained from ATCC and cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum, antibiotics, and various concentrations of compounds (DMSO control, UNC1999, or UNC2400). The medium containing the test compound or control is refreshed every 3 days. The numbers of viable cells from at least three independent experiments are measured using TC20 automated cell counter system. Total histones are prepared from cell nuclei using an acidic extraction protocol. About 1 μg of total histones is separated using 15% SDS-PAGE, transferred to PVDF membranes, and probed with histone antibodies. Antibodies used in this study are those against EZH2, general H3, and H3K27me3.

Male Swiss albino mice

~150 mg/kg (i.p.), ~50 mg/kg (oral)

Intraperitoneal administration or oral administration