Dovitinib (TKI258) Lactate monohydrate

Dovitinib remt krachtig de FGF-gestimuleerde groei van WT- en F384L-FGFR3-expresserende B9-cellen met een IC50 van 25 nM. Bovendien remt Dovitinib de proliferatie van B9-cellen die elk van de verschillende geactiveerde mutanten van FGFR3 tot expressie brengen. Interessant is dat er minimale waargenomen verschillen zijn in de gevoeligheid van de verschillende FGFR3-mutaties voor Dovitinib, waarbij de IC50 varieert van 70 tot 90 nM voor elk van de verschillende mutaties. IL-6-afhankelijke B9-cellen die alleen een vector bevatten (B9-MINV-cellen) zijn resistent tegen de remmende activiteit van Dovitinib bij concentraties tot 1 μM. Dovitinib remt de celproliferatie van KMS11 (FGFR3-Y373C), OPM2 (FGFR3-K650E) en KMS18 (FGFR3-G384D) cellen met een IC50 van respectievelijk 90 nM (KMS11 en OPM2) en 550 nM. Dovitinib remt FGF-gemedieerde ERK1/2-fosforylering en induceert cytotoxiciteit in FGFR3-expresserende primaire MM-cellen. BMSCs verlenen een bescheiden mate van resistentie met 44,6% groeiremming voor cellen behandeld met 500 nM Dovitinib en gekweekt op stroma, vergeleken met 71,6% groeiremming voor cellen gekweekt zonder BMSCs. Dovitinib remt de proliferatie van M-NFS-60, een M-CSF-groeigedreven muis myeloblastische cellijn met een mediane effectieve concentratie (EC50) van 220 nM. [1] Behandeling van SK-HEP1-cellen met Dovitinib resulteert in een dosisafhankelijke vermindering van het celnummer en G2/M-fase-arrestatie met vermindering in de G0/G1- en S-fasen, remming van anchorage-onafhankelijke groei en blokkering van bFGF-geïnduceerde celmotiliteit. De IC50 voor Dovitinib in SK-HEP1-cellen is ongeveer 1,7 μM. Dovitinib vermindert ook significant de basale fosforyleringsniveaus van FGFR-1, FGFR substrate 2α (FRS2-α) en ERK1/2, maar niet Akt in zowel SK-HEP1- als 21-0208-cellen. In 21-0208 HCC-cellen remt Dovitinib significant bFGF-geïnduceerde fosforylering van FGFR-1, FRS2-α, ERK1/2, maar niet Akt. [2]

Dovitinib induceert zowel cytostatische als cytotoxische responsen in vivo, wat resulteert in regressie van FGFR3-expresserende tumoren.[1] Dovitinib toont een dosis- en blootstellingsafhankelijke remming van doelreceptor tyrosinekinasen (RTK's) tot expressie gebracht in tumortransplantaten. Dovitinib remt krachtig de tumorgroei van zes HCC-lijnen. Remming van Angiogenesis correleerde met inactivatie van FGFR/PDGFR P /VEGFR2 signaalwegen. In een orthotoop model remt Dovitinib krachtig de primaire tumorgroei en longmetastase en verlengde significant de overleving van muizen. [2] Toediening van Dovitinib resulteert in significante tumorgroeiremming en tumorregressies, inclusief grote, gevestigde tumoren (500-1.000 mm³). [3]

• In vitro kinase testen

  De remmende concentratie van 50% (IC50) waarden voor de remming van RTK's door Dovitinib worden bepaald in een tijdopgeloste fluorescentie (TRF) of radioactieve vorm, waarbij de remming door Dovitinib van fosfaatoverdracht naar een substraat door het respectievelijke enzym wordt gemeten. De kinase domeinen van FGFR3, FGFR1, PDGFR P en VEGFR1-3 worden getest in 50 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N^'-2-ethaansulfonzuur), pH 7.0, 2 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂ 1 mM NaF, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mg/mL bovine serum albumine (BSA), 0.25 μM gebiotinyleerd peptide substraat (GGGGQDGKDYIVLPI), en 1 tot 30 μM adenosine trifosfaat (ATP) afhankelijk van de K_m voor het respectievelijke enzym. ATP-concentraties zijn op of net onder K_m. Voor c-KIT en FLT3 reacties wordt de pH verhoogd tot 7.5 met 0.2 tot 8 μM ATP in aanwezigheid van 0.25 tot 1 μM gebiotinyleerd peptide substraat (GGLFDDPSYVNVQNL). Reacties worden 1 tot 4 uur geïncubeerd bij kamertemperatuur en het gefosforyleerde peptide wordt opgevangen op streptavidin-gecoate microtiterplaten die een stopreactiebuffer bevatten (25 mM EDTA [ethyleendiaminetetraazijnzuur], 50 mM HEPES, pH 7.5). Gefosforyleerd peptide wordt gemeten met het DELFIA TRF-systeem met behulp van een Europium-gelabeld anti-fosfotyrosine antilichaam PT66. De concentratie van Dovitinib voor IC50 wordt berekend met behulp van niet-lineaire regressie met XL-Fit data-analysesoftware versie 4.1 (IDBS). Remming van colony-stimulating factor-1 receptor (CSF-1R), PDGFR P , insulinereceptor (InsR) en insulin-like growth factor receptor 1 (IGFR1) kinase activiteit wordt bepaald bij ATP-concentraties dicht bij de K_m voor ATP.

• Cellijnen

  B9 cells, MM cell lines

• Concentraties

  100 nM

• Incubatietijd

  48-96 hours

• Methode

  Cell viability is assessed by 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyl tetrazolium (MTT) dye absorbance. Cells are seeded in 96-well plates at a density of 5 × 10³ (B9 cells) or 2 × 10⁴ (MM cell lines) cells per well. Cells are incubated with 30 ng/mL aFGF and 100 μg/mL heparin or 1% IL-6 where indicated and increasing concentrations of Dovitinib. For each concentration of Dovitinib, 10 μL aliquots of drug or DMSO diluted in culture medium is added. For drug combination studies, cells are incubated with 0.5 μM dexamethasone, 100 nM Dovitinib, or both simultaneously where indicated. To evaluate the effect of Dovitinib on growth of MM cells adherent to BMSCs, 10⁴ KMS11 cells are cultured on BMSC-coated 96-well plates in the presence or absence of Dovitinib. Plates are incubated for 48 to 96 hours. For assessment of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)-mediated growth, 5 × 10³ M-NFS-60 cells/well are incubated with serial dilutions of Dovitinib with 10 ng/mL M-CSF and without granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). After 72 hours cell viability is determined using Cell Titer-Glo Assay. Each experimental condition is performed in triplicate.

• Dierlijke modellen

  8-week-old female BNX mice bearing KMS11 cells

• Doseringen

  10, 30, or 60 mg/kg

• Toediening

  p.o.