Sulforhodamine B sodium salt

Sulforhodamine B colorimetrische test in celkweek om celproliferatie te analyseren
1. Bereid behandelingsoplossingen met voldoende volume voor triplo's in 96-well platen (50 μl per replica) of zes replicaten in 384-well platen (10 μl per replica). Zorg ervoor dat de volumes rekening houden met pipetteervariaties.
2. Behandelingsoplossingen kunnen worden bereid in een waterige oplossing (bijv. Opti-MEM voor transfecties) of een geschikt oplosmiddel (bijv. DMSO).
3. Verwijder het medium van celmonolagen en was cellen eenmaal met gesteriliseerde PBS. Voeg 1 ml (voor 100 mm platen) 0,25% trypsine toe om het celgroeioppervlak gelijkmatig te bedekken.
4. Incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten of totdat cellen beginnen te dissociëren. Inactiveer trypsine met 10 volumes kweekmedium met FBS. Meng op en neer om een homogene enkelvoudige celsuspensie te verkrijgen.
5. Breng de celsuspensie over naar een steriele Falcon-buis.
6. Bepaal de celconcentratie met behulp van een hematocytometerkamer met een 1:1 mengsel van celsuspensie en 0,4% trypaanblauwe oplossing. centrifugeer de cellen optioneel voor het tellen om trypsine te wassen en resuspendeer in een groeimedium.
7. Pas de celconcentratie aan met groeimedium (10% FBS) voor een geschikte celzaaidichtheid per putje.
8. Meng de behandelingsoplossingen en doseer 50 μl (96-wells formaat) of 10 μl (384-wells formaat) in elk putje.
9. Meng de celsuspensie grondig en voeg 50 μl (96-wells formaat) of 10 μl (384-wells formaat) toe aan elk putje met behandelingsoplossingen.
Opmerking: Zorg voor een gelijkmatige celverdeling op de bodem van het putje en vermijd schudden om 'ringeffecten' te voorkomen.
10. Reserveer drie putjes voor onbehandelde of vehikelcontrole en drie putjes voor achtergrondsubtractie en incubeer de plaat bij 37 °C met 5% CO2 totdat deze klaar is voor aflezing.
11. Voeg 25 μl (96-wells formaat) of 5 μl (384-wells formaat) van koud 50% TCA direct toe aan het medium supernatant. Incubeer platen bij 4 °C gedurende 1 uur zonder te mengen.
12. Was platen vier keer door ze onder te dompelen in langzaam stromend kraanwater en overtollig water op een papieren handdoek te tikken. Laat de plaat aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
13. Voeg 50 μl (96-wells formaat) of 20 μl (384-wells formaat) van 0,04% SRB-oplossing toe aan elk putje.
14. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en spoel de platen vier keer met 1% azijnzuur (200 μl voor 96-wells formaat of 30 μl voor 384-wells formaat). Laat de plaat aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
15. Voeg 50 μl tot 100 μl van 10 mM tris base-oplossing (pH 10,5) toe aan elk putje en schud de plaat gedurende 10 minuten op een orbitale shaker om de aan proteine gebonden kleurstof op te lossen.
16. Meet de absorptie bij 510 nm in een microplaatlezer.