AG-14361

AG14361은 벤자미드보다 최소 1000배 더 강력합니다. 투과성 SW620 세포에서 AG14361의 IC50은 29 nM이고, 온전한 SW620 세포에서는 14 nM입니다. 닭 PARP-1의 촉매 도메인에 결합된 AG14361의 결정학적 분석 결과, AG14361의 삼환계 고리 시스템은 아미노산 잔기 Trp861, His862, Gly863, Tyr896, Phe897, Ala898, Lys903, Ser904, Tyr907 및 Glu988로 구성된 포켓에 위치합니다. AG14361은 Ser904 및 Gly863과 중요한 수소 결합을 형성하고 Glu988과 물 매개 수소 결합을 형성합니다. AG14361 유도 성장 억제는 PARP-1 관련 효과에 기인하지 않는데, 이는 최대 PARP-1 억제가 GI50보다 훨씬 낮은 농도(≤1 μM)에서 관찰되기 때문입니다. 0.4 μM의 AG14361은 암세포 유전자 발현이나 성장에 영향을 미치지 않지만, 증식 억제 활성을 증가시키고 LoVo 세포에서 잠재적으로 치명적인 γ-방사선 손상으로부터의 회복을 73% 억제합니다. 또한, 0.4 μM AG14361은 마이크로어레이 분석에서 나타났듯이 유전자 발현을 실질적으로 변화시키지 않습니다. A549 세포를 0.4 μM AG14361에 17시간 노출해도 6800개 유전자의 발현은 변하지 않습니다. 따라서 0.4 μM AG14361이 세포 PARP-1 활성을 85% 이상 억제함에도 불구하고 유전자 발현과 세포 증식을 본질적으로 변화시키지 않아, 이 낮은 농도의 AG14361의 세포 효과가 PARP-1 억제에 특이적임을 나타냅니다. 더 높은 성장 억제 농도의 AG14361은 유전자 발현에 영향을 미치지만, 이러한 효과는 PARP-1 억제와 관련이 없을 가능성이 높은데, 이는 PARP^-/^- 및 PARP-1⁺/⁺ 세포에서 세포 증식이 동등하게 영향을 받기 때문입니다. AG14361은 혈류로 빠르게 흡수되어 종양과 간으로 분포되며, 뇌에서는 더 낮은 농도로 검출됩니다. 조직-혈장 농도 비율은 AG14361이 두 이종이식 모델 모두에서 시간이 지남에 따라 종양 조직에 유지되며, 종양 농도(2시간 동안 ≥15 μM)는 시험관 내에서 PARP-1 활성을 억제하는 데 필요한 농도를 초과함을 나타냅니다. [1] AG14361은 모든 MMR-능숙 세포에서 활성을 향상시키지만(1.5-3.3배), MMR-결핍 세포에서는 더 효과적이며(3.7-5.2배 강화) 내성을 극복합니다. 대조적으로, 벤질구아닌은 MMR-능숙 세포에서만 효능을 증가시키고 MMR-결핍 세포에서는 비효율적입니다. [2] AG14361은 토포아이소머라제 I 독극물의 성장 억제 및 세포 독성 효과를 향상시킵니다. AG14361은 캄프토테신 유도 DNA 단일 가닥 파괴의 지속성을 증가시킵니다. [3]

방사선 조사 전 AG14361 처리는 LoVo 이종이식을 가진 쥐의 방사선 요법에 대한 민감도를 통계적으로 유의하게 증가시킵니다. AG14361은 이종이식에서 혈류를 통계적으로 유의하게 증가시켜 잠재적으로 종양 이종이식으로의 약물 전달을 증가시킵니다. 생체 내에서 AG14361의 비독성 용량은 X선 조사에 의해 유도된 LoVo 이종이식 성장의 지연을 2~3배 증가시킵니다. AG14361의 공동 투여는 LoVo 이종이식에 대한 활성을 통계적으로 유의하게 증가시키며, 종양 성장 지연은 AG14361 5 mg/kg에서 3일에서 9일로, AG14361 15 mg/kg에서 10일로 증가합니다. AG14361의 조합은 SW620 이종이식 종양의 완전한 퇴행을 유발합니다. 약력학적 분석으로 검출된 SW620 이종이식에서의 PARP-1 활성은 AG14361 (10 mg/kg) 복강 내 투여 후 최소 4시간 동안 75% 이상 억제되며, 이는 종양에 잔류하는 AG14361의 농도와 일치합니다. [1]

• PARP-1 활성 분석

  전장 재조합 인간 PARP-1의 활성은 20 nM PARP-1, 500 μM NAD⁺와 [³²P]NAD⁺ (반응 혼합물 당 0.1–0.3 μCi), 그리고 활성화된 송아지 흉선 DNA (10 μg/mL)를 포함하는 반응 혼합물에서 25^oC에서 측정됩니다. 반응은 4분 후 얼음처럼 차가운 10% (w/v) 삼염화초산(trichloroacetic acid)을 첨가하여 종료됩니다. 산-불용성 물질에 통합된 반응 생성물 [³²P]ADP-리보스는 Bio-Dot 미세여과 장치를 사용하여 Whatman GF/C 유리 섬유 필터에 침전되고 PhosphorImager로 정량화됩니다. 0–600 nM에서 AG14361에 의한 PARP-1 활성 억제가 측정되며, AG14361의 K_i는 비선형 회귀 분석으로 계산됩니다.

• 세포주

  LoVo and SW620 colorectal cancer cells and A549 non–small-cell lung carcinoma cells.

• 농도

  0-20 μM

• 배양 시간

  5 days

• 방법

  LoVo and SW620 colorectal cancer cells and A549 non–small-cell lung carcinoma cells are maintained in RPMI-1640 medium containing 10% fetal calf serum. Cell growth inhibition is estimated in exponentially growing LoVo, A549, and SW620 cells in 96-well plates. Cells are exposed to AG14361 (0–20 μM) alone. After 5 days of culture, these cells are fixed with 10% trichloroacetic acid and stained with sulforhodamine B. The concentration of  AG14361 alone or in combination that inhibits growth by 50% (GI50) is calculated from computer-generated curves. Recovery from potentially lethal damage is measured in confluent LoVo cell cultures arrested in G1 phase to mimic the radiation-resistant quiescent cell population in tumors. Such cells are exposed to 8 Gy of γ-irradiation and then harvested and plated for colony formation assay immediately or maintained as growth-arrested confluent cultures for a 4-hour or 24-hour recovery period before harvesting and plating for the colony formation assay. Where indicated, 0.4 μM AG14361 is added 30 minutes before irradiation and is present in the recovery incubation.

• 동물 모델

  SW620 or LoVo xenografts in CD-1 nude mice

• 용량

  5 or 15 mg/kg

• 투여

  Treated intraperitoneally, once daily for 5 days