Belinostat (PXD101)

준성장 배양물을 수확하고 얼음처럼 차가운 PBS에서 두 번 세척한 다음 200 × g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿을 만듭니다. 세포 펠릿은 두 배 부피의 용해 완충액[60mM Tris 완충액(pH 7.4), 30% 글리세롤 및 450mM NaCl 포함]에 재현탁하고 세 번의 동결(드라이아이스)-해동(30°C 수조) 주기를 거쳐 용해시킵니다. 세포 잔해는 1.2 × 10⁴ g에서 5분 동안 원심분리하여 제거하고, 상층액은 -80°C에 보관합니다. 히스톤 H4 펩타이드(20개의 NH2-말단 잔기에 해당하는 서열 SGRGKGGKGLGKGGAKRHRK)는 아세트산의 공급원으로 [³H]아세틸 CoA를 사용하여 p300의 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘 도메인을 포함하는 재조합 단백질에 의해 아세틸화됩니다. H4 펩타이드(100 μg)는 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘 완충액(50 mM Tris HCl pH 8.0, 5% 글리세롤, 50 mM KCl 및 0.1 mM EDTA), 1 mM DTT, 1 mM 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐플루오라이드, 1 × 완전 프로테아제 억제제, 50 μL의 정제된 p300 및 1.85 m [³H]아세틸 CoA(4.50Ci/mmol)와 최종 부피 300 μL로 혼합하고 30 °C에서 45분 동안 배양합니다. p300 단백질은 20 μL의 50% Ni-아가로스 비드를 사용하여 4 °C에서 1시간 동안 배양하고 원심분리하여 제거합니다. 상층액은 2 mL Sephadex G15 컬럼에 적용하고, 통과액은 수집합니다. 1 밀리리터의 증류 H₂O를 부드럽게 적용하고, 세 방울 분획을 수집합니다. 이는 4–5 mL의 증류 H₂O가 추가될 때까지 반복되며, 약 40개의 분획이 수집됩니다. 각 분획 3 마이크로리터는 2 mL의 섬광액에 희석하여 섬광 계수기로 계수하여 표지된 펩타이드를 포함하는 분획을 식별합니다. 이 분획들은 합쳐지고, 결합된 샘플 1 μL를 측정하여 각 펩타이드 배치(3-7×10³ cpm/μL)의 방사능을 평가합니다. 활성 분석을 위해 반응은 총 부피 150 μL의 완충액[60 mM Tris (pH 7.4), 30% 글리세롤 포함]에 세포 추출물 2 μL, 그리고 사용된 경우 이 화합물 2 μL를 포함하여 수행됩니다. 반응은 [³H]표지된 기질(20개의 NH₂-말단 잔기에 해당하는 아세틸화된 히스톤 H4 펩타이드) 2 μL를 첨가하여 시작됩니다. 샘플은 37 °C에서 45분 동안 배양하고, 반응은 HCl 및 아세트산(최종 농도 각각 0.72 및 0.12 M)을 첨가하여 중단됩니다. 방출된 [³H]아세트산은 750 μL의 에틸 아세테이트로 추출하고, 샘플은 1.2× 10⁴ g에서 5분 동안 원심분리됩니다. 상층(600 μL)은 3 mL의 섬광액으로 옮겨져 계수됩니다.

A2780, A2780/cp70, 2780AD, HCT116, HT29, WIL, CALU-3, MCF7, PC3 and HS852

0.016 - 10 μM

24 hours

Tumor cell lines are seeded in 5 mL of medium at a density of 8 × 10⁴ cells/25 cm2 flask and incubated for 48 hours. Cells are exposed to Belinostat (0.016 to 10 μM) for 24 hours. The medium is removed, and 1 mL of trypsin/EDTA is added to each flask. Once the cells have detached, 1 mL of medium is added, the cells are resuspended, and those from the control untreated flask are counted. Cells are diluted and plated into 6-cm Petri dishes (three per flask) at a density of 0.5-2× 10³ cells/dish depending on the cell line. Cells from the drug-treated flasks are diluted and plated as for the control flasks. Dishes are incubated for 10–15 days at 37 °C. Cells are washed with PBS, fixed in methanol, and stained with crystal violet, and colonies that contained ≥50 cells counted. Sensitivity is expressed as the IC50 defined as the concentration of this compound required to reduce the number of colonies to 50% of that of the control untreated cells.

A2780, A2780/cp70 and HCT116 cells are injected s.c. into the right flank of CD1 nu/nu mice.

≤40 mg/kg

Administered via i.p.