Flavopiridol (Alvocidib, HMR-1275)

CDK1/cyclin B1 키나아제 분석의 경우, 키나아제 반응은 100 ng의 바큘로바이러스 발현 GST-CDK1/cyclin B1 (인간) 복합체, 1 μg의 히스톤 HI, 0.2 μCi의 [γ-³³P]ATP, 25 μM의 ATP를 50 μL의 키나아제 완충액(50 mM Tris, pH 8.0, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 0.5 mM DTT)에 포함합니다. CDK2/cyclin E 키나아제 분석의 경우, 키나아제 반응은 5 ng의 바큘로바이러스 발현 GST-CDK2/cyclin E (인간) 복합체, 0.5 μg의 GST-RB 융합 단백질 (레티노블라스토마 단백질의 아미노산 776-928), 0.2 μCi의 [γ-³³P]ATP, 25 μM의 ATP를 50 μL의 키나아제 완충액(50 mM Hepes, pH 8.0, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 2 mM DTT)에 포함합니다. CDK4/cyclin D1 키나아제 분석의 경우, 키나아제 반응은 150 ng의 바큘로바이러스 발현 GST-CDK4/cyclin D1 (인간), 280 ng의 Stag-cyclin D1, 0.5 μg의 GST-RB 융합 단백질 (레티노블라스토마 단백질의 아미노산 776-928), 0.2 μCi의 [γ-³³P]ATP, 25 μM의 ATP를 50 μL의 키나아제 완충액(50 mM Hepes, pH 8.0, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 2 mM DTT)에 포함합니다. 반응은 CDK1 및 CDK2의 경우 45분, CDK4의 경우 1시간 동안 30 °C에서 배양되고, 최종 농도 15%의 차가운 트리클로로아세트산(TCA)을 첨가하여 중단됩니다. TCA 침전물은 Filtermate 범용 수확기를 사용하여 GF/C unifilter 플레이트에 수집되며, 필터는 TopCount 96웰 액체 섬광 계수기를 사용하여 정량화됩니다. Flavopiridol (Alvocidib)은 디메틸포름아미드(DMF)에 10 mM로 용해되고 6가지 농도에서 각각 삼중으로 평가됩니다. 분석에서 DMF의 최종 농도는 2%입니다. IC50 값은 비선형 회귀 분석을 통해 도출되며 변동 계수 = 16%입니다. CDK6에 대한 활성을 분석하기 위해 필터 결합 분석이 확립됩니다. 반응 혼합물에는 다음이 결합됩니다: 2 μL의 CDK6 (0.7 mg/μL), 5 μL의 히스톤 H1 (6 mg/mL), 14 μL의 키나아제 완충액 (60 mM β-글리세로포스페이트, 30 mM p-니트로페닐 포스페이트, 25 mM MOPS (pH 7.0), 5 mM EGTA, 15 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0.1 mM Na-바나데이트), 50% DMSO에 희석된 증가하는 농도의 이 화합물 3 μL, 90 μM 농도 (최종 농도: 15 μM)의 비방사성 ATP에 있는 ³³P-ATP (1 mCi/mL) 6 μL. 분석은 ³³P-ATP 첨가로 시작됩니다. 반응은 30°C에서 20분 동안 배양됩니다. 상층액의 25 μL 분취량은 Whatman P81 포스포셀룰로스 종이에 점적됩니다. 필터는 1% 인산 용액으로 5회 세척됩니다. 젖은 필터는 1 mL의 섬광액 존재 하에 계수됩니다. Cdk9 활성은 50 mM HEPES pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 3 μM Na₃VO₄, 150 μM RNA polymerase CDT 펩타이드 및 80 μM ATP에서 50 nM의 재조합 Cdk9/cyclin T를 사용하여 측정됩니다. Cdk7 분석은 200 μM ATP 및 10 μM 미엘린 결합 단백질을 기질로 사용하여 37 nM의 정제된 키나아제 존재 하에 동일한 완충액에서 수행됩니다. CDK9 및 CDK7에 대한 효능은 강한 음이온 교환기 (Dowex 1-X8 수지, 포름산 형태) 기반 분석 또는 섬광 근접 분석을 사용하여 결정됩니다. IC50 값은 용량-반응 곡선에서 계산됩니다.

MCF-7, LNCAP, PC3, HCT116, CACO-2, A549, HL60, K562 cells and et al.

Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

72 hours

Cells are exposed to various concentrations of Flavopiridol (Alvocidib) for 72 hours, at which time the tetrazolium dye, MTS in combination with phenazine methosulfate, is added. After 3 hours, the absorbency is measured at 492 nm, which is proportional to the number of viable cells. The results are expressed as IC50 values. For cell cycle analysis, cells are fixed in paraformaldehyde and ethanol, washed, resuspended in a staining solution of TdT enzyme and FITC-dUTP, washed, stained with PI following RNase treatment, and then analyzed by flow cytometry.

Female Balb/c×DBA/2J F1 mice inoculated ip with P388 ascites leukemic cells, and Balb/c nu/nu nude mice subcutaneous implanted with A2780, Br-cycE, or A431 cells

~7.5 mg/kg/day

Injection i.p.