KU-0063794

mTOR 억제제 PP242와 비교할 때, KU-0063794는 PI3K 또는 76개의 다른 키나제에 대해 비활성이므로 mTOR에 대한 더 높은 특이성을 보입니다. HEK-293 세포에서 이 화합물 30 nM은 소수성 모티프(Thr³⁸⁹)의 인산화를 차단하고 이어서 T-루프 잔기(Thr²²⁹)의 인산화를 차단함으로써 S6K1 활성을 신속하게 제거하기에 충분합니다. 혈청 결핍 HEK-293 세포의 IGF1 자극의 경우, 이 화합물 300 nM이 S6K1 활성을 약 90% 억제하는 데 필요합니다. 이 화학 물질 100-300 nM은 또한 아미노산 유도 S6K1 및 S6 단백질의 인산화를 완전히 억제합니다. S6K1과 유사하게, mTORC1의 Ser²⁴⁴⁸ 및 mTORC2의 Ser²⁴⁸¹의 인산화를 용량 의존적 및 시간 의존적으로 억제합니다. 혈청 존재 하 또는 IGF1 자극 후, 이 화합물은 Akt의 Ser⁴⁷³ 및 예상치 못한 Thr³⁰⁸의 활성 및 인산화뿐만 아니라 Akt 기질 PRAS40의 Thr²⁴⁶, GSK3α/GSK3β의 Ser²¹/Ser⁹ 및 Foxo-1/3a의 Thr²⁴/Thr³²의 인산화를 용량 의존적으로 억제합니다. 이 화합물은 라파마이신과 달리 SGK1 활성 및 Ser⁴²² 인산화뿐만 아니라 그 생리적 기질 NDGR1을 S6K1 및 Akt 인산화와 동일한 정도로 용량 의존적으로 억제하는 반면, 포르볼 에스테르 유도 ERK 또는 RSK 인산화 및 RSK 활성화는 억제하지 않습니다. 라파마이신과 비교할 때, 이 화학 물질은 Thr³⁷, Thr⁴⁶ 및 Ser⁶⁵에서 4E-BP1의 완전한 탈인산화를 유도하는 데 더 중요한 효능을 보입니다. 야생형 및 mLST8 결핍 MEF 모두의 세포 성장을 억제하고 G1 세포 주기 정지를 유도하며, 라파마이신보다 더 중요합니다. [1]

Ku0063794는 전임상 신장 세포 암종 모델에서 종양 성장 및 mTOR 신호 전달을 억제합니다. 그러나 이 화합물은 동물 연구에서 더 효과적이지 않았습니다. 이 화학 물질의 생체 내에서 더 큰 활성이 부족한 이유에 대한 가능한 설명은 다음과 같습니다.[2].

• mTOR 복합체 키나제 분석

  HEK-293 세포를 Hepes 용해 완충액에 신선하게 용해합니다. 용해물(1-4 mg)은 전면역 IgG에 접합된 Protein G-Sepharose 5-20 μL와 함께 배양하여 사전 제거합니다. 그런 다음 용해물 추출물을 5-20 μL의 Protein G-Sepharose에 접합된 5-20 μg의 항-Rictor 또는 항-Raptor 항체 또는 전면역 IgG와 함께 배양합니다. 모든 항체는 Protein G-Sepharose에 공유 결합되어 있습니다. 면역침전은 진동 플랫폼에서 4 °C에서 1시간 동안 수행됩니다. 면역침전물은 Hepes 용해 완충액으로 4번 세척한 다음 Hepes 키나제 완충액으로 2번 세척합니다. S6K1 인산화에 사용되는 Raptor 면역침전물의 경우, 초기 두 번의 세척 단계에서 완충액에는 최적의 키나제 활성을 보장하기 위해 0.5 M NaCl이 포함됩니다. GST-Akt1은 PI-103 (1 μM, 1시간)과 함께 배양된 혈청 결핍 HEK-293 세포에서 분리됩니다. GST-S6K1은 라파마이신 (0.1 μM, 1시간)과 함께 배양된 혈청 결핍 HEK-293 세포에서 정제됩니다. mTOR 반응은 다양한 농도의 KU-0063794 및 GST-Akt1 (0.5 μg) 또는 GST-S6K1 (0.5 μg) 존재 하에 0.1 mM ATP 및 10 mM MgCl₂를 첨가하여 시작됩니다. 반응은 진동 플랫폼에서 30 °C에서 30분 동안 수행되고 SDS 샘플 완충액을 첨가하여 중단됩니다. 반응 혼합물은 0.22 μm 기공 크기 Spin-X 필터를 통해 여과되고 샘플은 표시된 항체를 사용하여 전기영동 및 면역 블롯 분석에 제출됩니다.

• 세포주

  Wild-type and mLST8 deficient MEFs

• 농도

  Dissolved in DMSO, final concentration ~3 μM

• 배양 시간

  24, 48, and 72 hours

• 방법

  Cells are treated with KU-0063794 for 24, 48, and 72 hours, and the medium is changed every 24 hours with freshly dissolved this compound. For the measurement of cell growth, cells are washed once with PBS, and fixed in 4% (v/v) paraformaldehyde in PBS for 15 minutes. After washing once with water, the cells are stained with 0.1% Crystal Violet in 10% ethanol for 20 minutes and washed three times with water. Crystal Violet is extracted from cells with 0.5 mL of 10% (v/v) ethanoic (acetic) acid for 20 minutes. The eluate is then diluted 1:10 in water and absorbance at 590 nm is quantified. For the assessment of cell cycle distribution, cells are harvested by trypsinization, washed once in PBS, and re-suspended in ice-cold aq. 70% (v/v) ethanol. Cells are washed twice in PBS plus 1% (w/v) BSA and stained for 20 minutes in PBS plus 0.1% (v/v) Triton X-100 containing 50 g/mL propidium iodide and 50 g/mL RNase A. The DNA content of cells is determined using a FACSCalibur flow cytometer and CellQuest software. Red fluorescence (585 nm) is acquired on a linear scale, and pulse width analysis is used to exclude doublets. Cell-cycle distribution is determined using FlowJo software.

• 동물 모델

  Nu/Nu nude mice

• 용량

  8 mg/kg

• 투여

  i.p.