OSI-027

OSI-027은 mTORC1 및 mTORC2에 대해 각각 22 nM 및 65 nM의 IC50을 갖는 선택적이고 ATP 경쟁적인 억제 활성을 나타냅니다. 또한, 이 화합물은 세포 기반 분석에서 1 μM의 IC50으로 phospho-4E-BP1의 mTOR 신호 전달을 억제합니다. [1] U937, KG-1, KBM-3B, ML-1, HL-60 및 MEG-01 세포를 포함한 여러 골수/거핵구 계열의 급성 백혈병 세포주에 대해 용량 의존적인 방식으로 항증식 활성을 나타냅니다. [2] 최근 연구에 따르면 이 화학 물질에 의한 mTORC1/2 억제는 유방암 세포에서 Akt (S473) 인산화 및 세포 증식을 효과적으로 억제합니다. [3]

GEO 결장직장 이종이식에서 OSI-027 (65 mg/kg)은 4E-BP1, Akt 및 S6 인산화를 포함한 mTORC1 및 mTORC2 이펙터 모두를 억제합니다. 또한, 이 화합물에 의한 mTORC1 및 mTORC2의 동시 억제는 라파마이신에 의한 mTORC1 억제보다 종양 성장을 더 강력하게 억제합니다. [1]

• 생화학 분석

  mTORC1 및 mTORC2 억제는 1 mM ATP에서 HeLa 용해물로부터 면역침전된 천연 효소 복합체를 사용하여 분석됩니다. HeLa 세포로부터 전체 세포 용해물을 준비하기 위해, 25 g의 세포 펠렛을 60 mL의 얼음처럼 차가운 완충액 A [40 mM HEPES (pH 7.5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM 피로인산나트륨, 10 mM 글리세로포스페이트, 50 mM NaF, 0.5 mM 오르토바나데이트 및 0.3% CHAPS를 포함하는 EDTA-free 프로테아제 억제제]에 30분 동안 냉장실에서 마그네틱 교반기로 용해시킵니다. 13,000 g에서 10분간 원심분리하여 용해물을 투명하게 만든 후, Protein G 코팅된 384웰 플레이트를 15 μL 완충액 A에 0.25 μg mTOR 항체와 함께 4 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 각 웰에 15 μL 완충액 A에 40 μg HeLa 세포 용해물을 첨가하고 4 °C에서 밤새 배양하여 mTOR 복합체를 면역침전시킵니다. 플레이트는 완충액 A로 3회, 면역침전 세척 완충액 [완충액 B: 50 mM HEPES (pH 7.5) 및 150 mM NaCl]으로 2회 세척합니다. OSI-027은 각 웰에 10 μM 농도로 첨가되고 DMSO는 대조군 웰에 첨가됩니다. 반응은 신선하게 준비된 키나아제 완충액 [완충액 C: 20 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 4 mM MnCl₂, 10 mM β-메르캅토에탄올 및 200 μM 바나데이트] 25 μL에 100 μM ATP 존재 또는 부재 하에 150 ng의 His-태그 4E-BP1을 기질로 각 웰에 첨가하여 시작되고 실온 (RT)에서 30분 동안 배양됩니다. 반응은 각 웰에서 25 μL의 반응 혼합물을 새로운 Ni-킬레이트 코팅 플레이트의 해당 웰로 옮긴 후 4 °C에서 밤새, 이어서 37 °C에서 2시간 동안 배양하여 중단됩니다. 4E-BP1의 인산화를 감지하기 위해, 플레이트를 5% 탈지분유가 포함된 TBST (0.1% Tween-20을 포함하는 Tris-완충 식염수)로 한 번 세척합니다. 각 웰에 5% 탈지분유가 포함된 TBST에 1:1,000 희석된 phospho-4E-BP1 항체 25 μL를 첨가하고 RT에서 1시간 동안 배양합니다. 플레이트는 TBST로 한 번 세척한 다음, 5% 탈지분유가 포함된 TBST에 25 μL의 항-토끼 HRP (1:10,000 희석)를 첨가합니다. 플레이트는 RT에서 1시간 동안 배양하고 TBST로 5회 세척합니다. phospho-4E-BP1 검출을 위해, 25 μL의 화학발광 시약 A+B를 첨가하고 Analyst 플레이트 리더를 사용하여 화학발광을 측정합니다.

• 세포주

  U937, KG-1, KBM-3B, ML-1, HL-60, and MEG-01

• 농도

  0-10 μM

• 배양 시간

  72 hours

• 방법

  Inhibition of proliferation is measured using the Cell Titer Glo Assay , as noted in figure legends. To generate dose–response curves, cell lines are seeded at a density of 5,000 cells per well in a 96-well plate. After 24 hours of plating, cells are dosed with varying concentrations of either OSI-027 or this compound. The signal for Cell Titer Glo Assay is determined 72 hours after dosing and normalized to that of vehicle-treated controls. Inhibition of proliferation, relative to vehicle-treated controls, is expressed as a fraction of 1 and graphed using PRISM software.

• 동물 모델

  GEO colorectal cells are injected s.c. into the right flank of nu/nu CD-1 mice.

• 용량

  ≤65 mg/kg

• 투여

  Administered via gavage.