PF-02341066 (Crizotinib)

PF-2341066은 mIMCD3 마우스 또는 MDCK 개 상피 세포에서 c-Met 인산화에 대해 유사한 효능을 보이며, IC50은 각각 5 nM 및 20 nM입니다. 이 화합물은 야생형 수용체를 발현하는 NIH3T3 세포(IC50 13 nM)와 비교하여 c-Met ATP 결합 부위 돌연변이 V1092I 또는 H1094R 또는 P-루프 돌연변이 M1250T를 발현하도록 조작된 NIH3T3 세포에 대해 IC50이 각각 19 nM, 2 nM 및 15 nM로 개선되거나 유사한 활성을 보입니다. 대조적으로, c-Met 활성화 루프 돌연변이 Y1230C 및 Y1235D를 발현하도록 조작된 세포에 대해서는 야생형 수용체와 비교하여 IC50이 각각 127 nM 및 92 nM로 이 화합물의 효능에 현저한 변화가 관찰됩니다. 또한 NCI-H69 및 HOP92 세포에서 c-Met 인산화를 강력하게 억제하며, IC50은 각각 13 nM 및 16 nM이고, 이들 세포는 내인성 c-Met 변이체 R988C 및 T1010I를 각각 발현합니다. 이 화합물은 VEGFR2 및 PDGFRβ RTK에 대해 >1,000배, IRK 및 Lck에 대해 >250배, Tie2, TrkA 및 TrkB에 대해 ~40~60배 선택성을 보이며, 모두 c-Met과 비교한 것입니다. RON 및 Axl RTK에 대해서는 20~30배 선택성을 보입니다. 대조적으로, 이 화합물은 KARPAS299 인간 역형성 대세포 림프종(ALCL) 세포주에 의해 발현되는 ALK RTK의 뉴클레오포스민(NPM)-역형성 림프종 키나제(ALK) 종양유전성 융합 변이체에 대해 거의 동일한 IC50인 24 nM을 보입니다. 암세포의 c-Met 의존성 신생물 표현형 및 내피 세포의 혈관신생 표현형을 억제합니다. 이 화학 물질은 인간 GTL-16 위암 세포 성장을 IC50 9.7 nM로 억제합니다. GTL-16 세포에서 IC50 8.4 nM로 세포자멸사를 유도합니다. HGF로 자극된 인간 NCI-H441 폐암 세포 이동 및 침윤을 IC50 11 nM 및 6.1 nM로 각각 억제합니다. MDCK 세포 산란을 IC50 16 nM로 억제합니다. HGF로 자극된 c-Met 인산화, 세포 생존 및 Matrigel 침윤을 IC50 11 nM, 14 nM 및 35 nM로 각각 억제합니다. 또한, 혈청으로 자극된 HMVEC 가지 형성 관 형성(혈관 튜브 형성)을 피브린 젤에서 억제합니다. [1] 또한 Karpas299 또는 SU-DHL-1 ALCL 세포에서 NPM-ALK 인산화를 IC50 24 nM로 강력하게 억제합니다. 이 화합물은 세포 증식을 강력하게 억제하며, 이는 G(1)-S기 세포 주기 정지 및 ALK 양성 ALCL 세포에서 IC50 30 nM로 세포자멸사 유도와 관련이 있지만, ALK 음성 림프종 세포에서는 그렇지 않습니다. [2] 또한, 원발성 종양 성장(즉, 증식 및 생존) 및 전이(예: 침윤 및 클론 형성)와 관련된 골육종 행동을 예방합니다. [3]

GTL-16 모델에서 PF-2341066은 50 mg/kg/일 및 75 mg/kg/일 치료 코호트 모두에서 43일 투여 일정 동안 평균 종양 부피가 60% 감소하여 크고 확립된 종양(>600 mm³)의 현저한 퇴행을 유발하는 능력을 보여줍니다. 다른 연구에서는 이 화합물이 GTL-16 종양 성장을 3개월 이상 완전히 억제하는 능력을 보였으며, 12마리 쥐 중 1마리만이 50 mg/kg/일의 3개월 치료 일정 동안 종양 성장이 유의하게 증가했습니다. NCI-H441 NSCLC 모델에서 38일 PF-2341066 투여 주기 동안 50 mg/kg/일에서 평균 종양 부피가 43% 감소하는 것이 관찰되었습니다. Caki-1 RCC 모델에서 33일 PF-2341066 투여 주기 동안 50 mg/kg/일에서 각 종양의 부피가 최소 30% 감소하는 것과 관련된 평균 종양 부피가 53% 감소하는 것이 관찰되었습니다. 이 화합물은 또한 U87MG 교모세포종 또는 PC-3 전립선암 이종이식 모델에서 50 mg/kg/일에서 확립된 종양의 성장을 거의 완전히 예방하는 것을 보여주었으며, 연구 마지막 날 각각 97% 또는 84% 억제되었습니다. 대조적으로, 50 mg/kg/일로 경구 투여된 이 화학 물질은 MDA-MB-231 유방암 모델 또는 DLD-1 결장암 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제하지 않습니다. GTL-16 종양에서 12.5 mg/kg/일, 25 mg/kg/일 및 50 mg/kg/일에서 CD31 양성 내피 세포의 유의한 용량 의존적 감소가 관찰되었으며, 이는 MVD 억제가 항종양 효능과 용량 의존적 상관 관계를 보임을 나타냅니다. 이 화합물은 GTL-16 및 U87MG 모델 모두에서 인간 VEGFA 및 IL-8 혈장 수치의 유의한 용량 의존적 감소를 보입니다. 이 화합물의 경구 투여 후 GTL-16 종양에서 인산화된 c-Met, Akt, Erk, PLCλ1 및 STAT5 수치의 현저한 억제가 관찰되었습니다.[1] Karpas299 ALCL 종양 이종이식을 이식한 SCID-Beige 마우스에 이 화학 물질을 경구 투여하면 초기 화합물 투여 후 15일 이내에 100 mg/kg/d 용량에서 모든 종양의 완전한 퇴행과 함께 용량 의존적 항종양 효능이 나타납니다. 또한, 포스포리파제 C-감마, 신호 전달 및 전사 활성제 3, 세포외 신호 조절 키나아제, Akt를 포함한 주요 NPM-ALK 신호 전달 매개체의 이 화합물에 의한 억제는 NPM-ALK 인산화 및 기능 억제와 상관 관계가 있는 농도 또는 용량 수준에서 관찰되었습니다.[2] 이 화합물은 원발성 종양 성장(예: 증식 및 생존) 및 전이(예: 침윤 및 클론 형성)와 관련된 골육종 행동을 예방합니다. 이 화학 물질을 경구 위관 영양으로 처리한 누드 마우스에서 골육종 이종이식편의 성장 및 관련 골용해 및 피질외 골 기질 형성은 이 화합물에 의해 예방됩니다.[3] 50 mg/kg의 이 화합물로 c-MET 증폭 GTL-16 이종이식편을 치료하면 ¹⁸F-FDG 섭취의 느린 감소 및 포도당 수송체 1, GLUT-1의 발현 감소와 관련된 종양 퇴행이 유도됩니다.[4]

• 세포 키나아제 인산화 ELISA 분석

  세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 배지에 96웰 플레이트에 접종하고 24시간 후 무혈청 배지[0.04% 소 혈청 알부민(BSA) 포함]로 옮깁니다. 리간드 의존성 RTK 인산화를 조사하는 실험에서는 해당 성장 인자를 최대 20분 동안 첨가합니다. 세포를 이 화합물과 1시간 동안 및/또는 지정된 시간 동안 적절한 리간드와 함께 배양한 후, 세포를 1mM Na₃VO₄가 보충된 HBSS로 한 번 세척하고 세포에서 단백질 용해물을 생성합니다. 이어서, 96웰 플레이트 코팅에 사용되는 특정 포획 항체와 인산화된 티로신 잔기에 특이적인 검출 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA 방법으로 선택된 단백질 키나아제의 인산화를 평가합니다. 항체 코팅 플레이트는 (a) 단백질 용해물 존재 하에 4°C에서 밤새도록 배양하고; (b) 1% Tween 20이 포함된 PBS로 7회 세척하고; (c) 서양 고추냉이 과산화효소-접합 항-총-인산티로신(PY-20) 항체(1:500)에 30분 동안 배양하고; (d) 다시 7회 세척하고; (e) 3,3′,5,5′-테트라메틸 벤지딘 과산화효소 기질에 배양하여 0.09 N H₂SO₄를 첨가하여 중단되는 비색 반응을 시작하고; (f) 분광광도계를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정합니다.

• 세포주

  GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells

• 농도

  0-256 nM

• 배양 시간

  1 hour

• 방법

  Cells including GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells are seeded in 96-well plates in media supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and transferred to serum-free media [with 0.04% bovine serum albumin (BSA)] after 24 hours. In experiments investigating ligand-dependent RTK phosphorylation, corresponding growth factors are added for up to 20 minutes. After incubation of cells with this compound for 1 hour and/or appropriate ligands for the designated times, cells are washed once with HBSS supplemented with 1 mM Na₃VO₄, and protein lysates are generated from cells. Subsequently, phosphorylation of selected protein kinases is assessed by a sandwich ELISA method using specific capture antibodies used to coat 96-well plates and a detection antibody specific for phosphorylated tyrosine residues. Antibody-coated plates are (a) incubated in the presence of protein lysates at 4 °C overnight; (b) washed seven times in 1% Tween 20 in PBS; (c) incubated in a horseradish peroxidase–conjugated anti–total-phosphotyrosine (PY-20) antibody (1:500) for 30 min; (d) washed seven times again; (e) incubated in 3,3^′,5,5^′-tetramethyl benzidine peroxidase substrate to initiate a colorimetric reaction that is stopped by adding 0.09 N H₂SO₄; and (f) measured for absorbance in 450 nm using a spectrophotometer.

• 동물 모델

  Female or male nu/nu mice bearing NCI-H441,or DLD-1, or MDA-MB-231

• 용량

  12.5 mg/kg/day, 25 mg/kg/day, and 50 mg/kg/day

• 투여

  Administered via p.o.