Pemetrexed Disodium (LY231514)

TS 활성은 생성물인 7,8-디히드로폴레이트 형성으로 인한 340 nm 흡광도 증가를 모니터링하는 분광광도법을 사용하여 분석됩니다. 분석 버퍼는 50 mM N-트리스[하이드록시메틸]메틸-2-아미노에탄설폰산, 25 mM MgC1₂, 6.5 mM 포름알데히드, 1 mM EDTA 및 75 mM 2-메르캅토에탄올, pH 7.4를 포함합니다. 데옥시우리딜레이트 모노포스페이트, 6R-MTHF 및 hIS의 농도는 각각 100 μM, 30μM 및 30 nM (1.7 밀리유닛/mL)입니다. 6R-MTHF 농도에서 비억제 반응과 6가지 농도의 억제제를 분석합니다. K_{i app} 값은 ENZFITTER 프로그램의 도움을 받아 비선형 회귀 분석을 사용하여 데이터를 Morrison 방정식에 맞춰 결정됩니다. K_i 값은 다음 방정식을 사용하여 계산됩니다: K_{i app}= K_i(1 + [S]/K_m), 여기서 [S]는 30 μM과 같고 K_m은 3 μM과 같습니다. DHFR 활성은 340 nm에서 기질 NADPH 및 7,8-디히드로폴레이트의 소실을 모니터링하여 분광광도법으로 분석됩니다. 반응은 25°C에서 0.5 mL의 50 mM 인산칼륨 버퍼(150 mM KC1 및 10 nM 2-메르캅토에탄올, pH 7.5 포함) 및 14 nM (0.34 밀리유닛/mL) DHFR에서 진행됩니다. NADPH 농도는 10 μM이고 7,8-디히드로폴레이트는 5, 10 또는 15 μM로 변화시킵니다. 각 7,8-디히드로폴레이트 농도에서 비억제 반응과 7가지 농도의 억제제를 분석합니다. ENZFITI'ER 마이크로컴퓨터 프로그램은 비선형 회귀 분석을 통해 데이터를 Morrison 방정식에 맞춰 K_{i app} 값을 얻는 데 사용됩니다. K_{i app}= K_i(1 + [S]/K_m), 여기서 [S]는 사용된 7,8-디히드로폴레이트의 농도와 같고 7,8-디히드로폴레이트의 K_m은 0.15 μM과 같습니다. GARFT 활성은 생성물인 5,8-디데아자폴레이트 형성으로 인한 295 nm 흡광도 증가를 모니터링하여 분광광도법으로 분석됩니다. 반응 용매는 25°C에서 75 mM HEPES, 20% 글리세롤 및 50 mM α-티오글리세롤, pH 7.5를 포함합니다. 사용된 기질 및 효소 농도는 10 μM α,β-글리신아미드 리보뉴클레오티드, 0-10 μM 10-포르밀-5,8-디데아자폴산 및 10 nM (1.9 밀리유닛/mL) GARFT입니다. K_i 값은 Beckman DU640 분광광도계의 효소 메커니즘 프로그램을 사용하여 계산되며, 이는 비선형 회귀 분석을 사용하여 데이터를 경쟁적 억제를 위한 Michaelis-Menten 방정식에 맞춥니다.

CCRF-CEM leukemia, GC3/C1 colon carcinoma, and HCT-8 ileocecal carcinoma cells.

0-30 μM

72 hours

Dose-response curves are generated to determine the concentration required for 50% inhibition of growth (IC50). Pemetrexed disodium is dissolved initially in DMSO at a concentration of 4 mg/mL and further diluted with cell culture medium to the desired concentration. CCRF-CEM leukemia cells in complete medium are added to 24-well Cluster plates in a total volume of 2.0 mL. This compound at various concentrations are added to duplicate wells so that the final volume of DMSO is 0.5%. The plates are incubated for 72 hour at 37 °C in an atmosphere of 5% CO₂ in air. At the end of the incubation, cell numbers are determined on a ZBI Coulter counter. For several studies, IC50s are determined for each compound in the presence of either 300 μM AICA, 5 μM thymidine, 100 μM hypoxanthine, or combination of 5 μM hymidine plus 100 μM hypoxanthine. For adherent tumor cells, a modification of the original MTT colorimetric assay is used to measure cell cytotoxicity. The human tumor cells are seeded in 100 μL assay medium/well in 96-well flat-bottomed tissue culture plates. The assay medium contains folic acid-free RPMI 1640 supplemented with 10% FCS and either 2 nM folinic acid or 2.3 μM folic acid as the sole folate source. Well 1A is left blank. Stock solutions of antifolates are prepared in Dulbecco's PBS at 1 mg/mL, and a series of 2-fold dilutions are subsequently made in PBS. Ten-μL aliquots of each concentration are added to triplicate wells. Plates are incubated for 72 hours at 37 °C in a humidified atmosphere of 5% CO₂-in-air. MTT is dissolved in PBS at 5 mg/mL, 10 μL of stock MTF solution are added to each well of an assay, and the plates are incubated at 37 °C for 2 additional hours. Following incubation, 100 μL of DMSO are added to each well. After thorough formazan solubilization, the plates are read on a Dynatech MR600 reader, using a test wavelength of 570 nm and a reference wavelength of 630 nm. The IC50 is determined as the concentration of drug required to inhibit cell growth by 50% compared to an untreated controls.

EMT-6 mammary carcinoma, the human HCT 116 colon carcinoma, and the human H460 non-small cell lung carcinoma are injected s.c. into the nude mice.

100 mg/kg or 150 mg/kg

Administered via i.p.