ZSTK474

1 μM의 ZSTK474는 PI3K 활성을 대조군의 4.7%로 강력하게 감소시키지만, LY2194002는 활성을 대조군의 44.6%로만 감소시킵니다. 이 화합물은 재조합 p110β, -γ, -δ의 활성을 각각 17 nM, 53 nM, 6 nM의 IC50으로 억제합니다. 평균 GI50이 0.32 μM인 39개의 인간 암세포주 패널에 대해 강력한 항증식 활성을 보이며, 평균 GI50이 7.4 μM 또는 10 μM인 LY294002 또는 wortmannin보다 더 효과적입니다. 1 μM의 이 화학적 처리는 쥐 배아 섬유아세포(MEF)에서 혈소판 유래 성장 인자에 의해 유도되는 막 러플링 및 PIP3 생성을 차단합니다. 10 μM에서 OVCAR3 세포에서 세포자멸사를 유도하고, A549 세포에서는 완전한 G1기 정지를 유도하지만 세포자멸사는 유도하지 않습니다. 0.5 μM의 이 화합물 처리는 인산화된 Akt 및 GSK-3β 수준과 cyclin D1 단백질 발현을 유의하게 감소시킵니다. 또한 FKHRL1, FKHR, TSC-2, mTOR 및 p70S6K를 포함한 세포 증식 조절에 관여하는 다른 하류 신호 구성 요소의 인산화를 용량 의존적으로 억제합니다. [1] 이 화학 물질은 0.1 μM에서 mTOR를 억제하지 않으며, 심지어 100 μM 농도에서도 mTOR 활성을 40% 미만으로 억제합니다. [2] 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에서 VEGF 유도 세포 이동 및 튜브 형성을 차단하고, RXF-631L 세포에서 HIF-1α 발현 및 VEGF 분비를 억제하여 강력한 시험관 내 항혈관신생 활성을 나타냅니다. [3] 이 화합물 처리는 콘카나발린 A 활성화 T 세포에서 IFNγ 및 IL-17 생성을 억제하고, 섬유아세포 유사 활막 세포(FLS)에 의한 증식 및 PGE(2) 생성을 억제합니다. [6]

• PI3K 활성 억제

  A549 세포를 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Igepal CA-630을 포함하는 완충액에 용해시키고, 용해물을 20,000 g 및 4 °C에서 10분 동안 원심분리한 다음, 상등액을 세포 용해물(단백질 = 2-4 mg/mL)로 사용합니다. PI3K를 면역침전시키기 위해, 200 μL의 세포 용해물을 항-p85 다클론 항체 및 단백질 G-아가로스(5 μL)와 함께 배양합니다. PI3Kα, PI3Kβ 및 PI3Kδ는 항-p85 다클론 항체에 의해 면역침전될 수 있습니다. 면역침전물을 포함하는 아가로스 비드는 완충액 A(20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Igepal CA-630)로 두 번, 완충액 B(500 mM LiCl 및 100 mM Tris-HCl, pH 7.5)로 한 번, 증류수로 한 번, 완충액 C(100 mM NaCl 및 20 mM Tris-HCl, pH 7.5)로 한 번 세척합니다. 면역침전물은 200 μg/mL의 포스파티딜이노시톨을 포함하는 20 μL의 완충액 C에 현탁됩니다. 혼합물은 이 화합물의 농도를 증가시키면서 25 °C에서 5분 동안 전배양됩니다. [γ-³²P]ATP (각 분석 혼합물당 2 μCi; 최종 농도, 20 μM) 및 MgCl₂ (최종 농도, 20 mM)를 첨가하여 반응을 시작합니다. 반응 혼합물은 25 °C에서 20분 동안 배양됩니다. 포스파티딜이노시톨의 인산화된 생성물은 박층 크로마토그래피로 분리되고 방사선 자동촬영으로 시각화됩니다. 포스파티딜이노시톨-3-인산 영역은 플레이트에서 긁어내고, 방사능은 액체 섬광 분광법으로도 측정됩니다. 이 화학 물질에 대한 억제 수준은 이 화합물 없이 얻은 ³²P 분당 카운트의 백분율로 결정됩니다.

• 세포주

  MCF-7, HT-29, HCT-116, OVCAR3, A549, et al.

• 농도

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

• 배양 시간

  48 hours

• 방법

  Cells are exposed to increasing concentrations of ZSTK474 for 48 hours. The inhibition of cell proliferation is assessed by measuring changes in total cellular protein by use of a sulforhodamine B assay. Apoptosis is assessed by chromatin condensation or by flow cytometry. For chromatin condensation assay, cells are stained with Hoechst 33342 and examined by fluorescence microscopy. Morphologic changes induced by this compound, such as the condensation of chromatin, are indicative of apoptosis. For flow cytometry analysis, cells are harvested, washed with ice-cold PBS, and fixed in 70% ethanol. Cells are then washed twice with ice-cold PBS again, treated with RNase A (500 μg/mL) at 37 °C for 1 hour, and stained with propidium iodide (25 μg/mL). The DNA content of the cells is analyzed with a flow cytometer.

• 동물 모델

  Male BDF1 mice injected subcutaneously with B16F10 cells, and female BALB/c nude mice inoculated subcutaneously with A549, PC-3, or WiDr cells

• 용량

  ~400 mg/kg/day

• 투여

  Orally