Afatinib Dimaleate

EGFR 인산화효소: 각 100 µL 효소 반응액은 50% Me2SO에 10 μL의 억제제, 20 μL의 기질 용액 (200 mM HEPES pH 7.4, 50 mM Mg-아세테이트, 2.5 mg/mL poly (EY), 5 μg/mL bio-pEY) 및 20 µL의 효소 제제를 포함했습니다. 효소 반응은 10 mM MgCl2에 제조된 100 µM ATP 용액 50 µL를 첨가하여 시작됩니다. 분석은 실온에서 30분 동안 수행되었으며 50 µL의 정지 용액 (20 mM HEPES pH 7.4에 250 mM EDTA)을 첨가하여 종료되었습니다. 100 µL를 스트렙타비딘 코팅된 마이크로플레이트에 옮긴 후, 실온에서 60분 배양 후 플레이트를 200 µL의 세척 용액 (50 mM Tris, 0.05% Tween20)으로 세척했습니다. HRPO-표지된 항-PY 항체 (PY20H Anti-Ptyr:HRP) 250 ng/mL 100 µL 분량을 웰에 첨가했습니다. 60분 배양 후, 플레이트를 200 µL 세척 용액으로 세 번 세척했습니다. 그런 다음 샘플을 100 µL TMB 과산화효소 용액 (A:B= 1:1)으로 현상했습니다. 반응은 10분 후에 중지됩니다. 플레이트는 ELISA 판독기로 옮겨지고 OD450nm에서 흡광도가 측정됩니다. HER2-IC 효소: 효소 활성은 50% Me2SO에서 수행된 일련의 억제제 희석액의 존재 또는 부재 하에 분석됩니다. 각 100 µL 반응액은 1000 µM Na3VO4를 추가하여 EGFR 인산화효소 분석에 설명된 것과 유사한 성분을 포함합니다. 효소 반응은 10 mM Mg-아세테이트에 제조된 500 µM ATP 용액 50 µL를 첨가하여 시작됩니다. 효소 희석은 bio-pEY에 인산염 통합이 시간 및 효소량에 대해 선형이 되도록 설정됩니다. 효소 제제는 20 mM HEPES pH 7.4, 130 mM NaCl, 0.05% Triton X-100, 1 mM DTT 및 10% 글리세롤에 희석됩니다. 분석은 실온에서 30분 동안 수행되었으며 50 µL의 정지 용액을 첨가하여 종료되었습니다. Src 인산화효소 분석: 각 100 µL 반응액은 50% Me2SO에 10 µL의 억제제, 20 µL의 효소 제제, 1000 µM Na3VO4가 보충된 20 µL의 기질 용액을 포함했습니다. 효소 반응은 10 mM Mg-아세테이트에 제조된 1000 µM ATP 용액 50 µL를 첨가하여 시작됩니다. BIRK 인산화효소 분석: 250 mM Tris pH 7.4, 10 mM DTT, 2.5 mg/mL poly(EY), 5 mg/mL bio-pEY를 기질 용액으로 사용하고, 효소 반응은 8 mM MnCl2, 20 mM Mg-아세테이트에 제조된 2 mM ATP 용액 50 µL를 첨가하여 시작됩니다. VEGF2 및 HGFR 인산화효소 분석: 분석은 실온에서 20분 동안 수행되었으며 10 µL의 5% H3PO4를 첨가하여 종료되었습니다. 침전물은 96웰 필터 메이트 범용 수확기를 사용하여 GF/B 필터에 포획됩니다. 광범위한 세척 후 필터 플레이트는 50°C에서 1시간 동안 건조되고 밀봉되며, 통합된 방사능은 TopCount™ 또는 Microbeta b counter™를 사용하여 섬광 계수로 결정됩니다.

SP and NSP cell lines

1 μM

48 h

Cytotoxicity is determined using MTT assay. The IC 50 value is defined as the drug concentration resulting in 50% cell death. Both the fitted sigmoidal dose response curve and IC50 are calculated by Bliss method.

SCID mice harbouring ARK2 xenografts

25 mg/kg

p.o.