Tivantinib

ARQ-197은 시험관 내에서 HGF/c-Met 유도 세포 반응을 방지하는 것으로 나타났습니다. 이 화합물은 A549, DBTRG 및 NCI-H441 세포의 증식을 IC50 0.38, 0.45, 0.29 μM로 억제하는 항종양 활성을 가지고 있습니다. 이 약물로 치료하면 MAPK 신호 전달 캐스케이드의 인산화가 감소하고 침윤 및 이동이 방지됩니다. 또한, c-Met의 내인성 발현이 없는 세포주인 NCI-H661에서 c-Met의 이소성 발현은 침윤성 표현형을 획득하게 하며, 이는 또한 이 화학 물질에 의해 억제됩니다. 이 억제제의 농도 증가가 ATP의 K_m에 유의미한 영향을 미치지 않지만, c-Met을 0.5 μM의 이 물질에 노출시키면 c-Met의 V_max가 약 3배 감소했습니다. 이 분자가 ATP의 Km에 영향을 미치지 않으면서 V_max를 감소시키는 능력은 비ATP 경쟁적 메커니즘을 통해 c-Met을 억제하며, 따라서 높은 키나제 선택성을 설명할 수 있음을 확인했습니다. 이는 계산된 억제 상수 K_i가 약 355 nM인 인간 재조합 c-Met을 방지합니다. 사용된 ATP의 최고 농도가 200 μM이지만, 1 mM까지의 ATP 농도를 사용해도 c-Met에 대한 이 화합물의 효능은 감소하지 않습니다. 이는 c-Met 인산화 및 다운스트림 c-Met 신호 전달 경로를 차단합니다. 이 화학 물질은 구성적 및 리간드 매개 c-Met 자가인산화를 억제하고, 나아가 c-Met 활성을 억제하여 다운스트림 c-Met 이펙터의 억제로 이어집니다. Caspase-의존성 apoptosis 유도는 HT29, MKN-45 및 MDA-MB-231 세포를 포함한 c-Met 발현 인간 암세포에서 증가합니다.[1][2]

Tivantinib으로 처리된 세 가지 이종이식 모델 모두 종양 성장 감소를 보였습니다: HT29 모델에서 66%, MKN-45 모델에서 45%, MDA-MB-231 모델에서 79%. 이 이종이식 연구에서, 이 화합물을 200 mg/kg로 경구 투여한 후 유의미한 체중 변화는 관찰되지 않았습니다. 약력학적으로, 인간 결장 이종이식 종양(HT29)에서 c-Met의 인산화는 이 약제를 200 mg/kg 단회 경구 투여 24시간 후 c-Met 자가인산화의 극적인 감소로 평가된 바와 같이 이 화학 물질에 의해 강력하게 억제됩니다. 생쥐에서 동일한 용량은 종양 이종이식이 화합물의 지속적인 혈장 수준에 노출됨을 보여주며, 이는 c-Met 인산화의 관찰된 약력학적 억제 및 c-Met을 보유한 암세포주의 증식 억제와 일치합니다. 투여 후 10시간에 이 약제의 혈장 수준은 1.3 μM로 결정되었으며, 이는 c-Met에 대한 이 물질의 생화학적 억제 상수보다 3배 이상 높습니다. 따라서, 이식된 인간 종양 조직에서 생체 내 표적을 억제할 수 있습니다. 결론적으로, 이 억제제는 c-Met 의존적인 이식된 인간 종양의 성장을 차단합니다.[1]

• c-Met SDS-PAGE 시험관 내 키나아제 분석

  재조합 c-Met 단백질(100 ng)은 이 화합물의 농도를 증가시키면서 실온에서 30분 동안 전배양됩니다. 전배양 후, 100 μM의 poly-Glu-Tyr 기질과 5 μCi의 [γ-32P]ATP를 포함하는 다양한 농도의 ATP가 반응 혼합물에 첨가됩니다. 반응은 실온에서 5분 동안 배양된 후 5 μL의 SDS-폴리아크릴아미드 겔, 환원 샘플 버퍼를 첨가하여 중지됩니다. 그런 다음 샘플은 7.5% 아크릴아미드 겔에 로딩되고 SDS-PAGE가 수행됩니다. 인산화된 poly-Glu-Tyr 기질은 최종적으로 자동방사선 촬영으로 시각화됩니다. c-Met 활성은 덴시토메트리로 정량됩니다.

• 세포주

  T29, MKN-45 and MDA-MB-231 cells

• 농도

  0.03-10 μM

• 배양 시간

  24, 32, and 48 hours

• 방법

  HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are seeded in black 96-well plates at 5 × 10³ cells per well overnight in a medium with 10% FBS. The next day, cells are treated with increasing concentrations of this compound (0.03-10 μM) for 24, 32, and 48 hours at 37 °C. After this compound treatment, the drug-containing medium is removed and cells are incubated for at least 10 minutes in a labeling solution (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, and 6 mM CaCl₂) containing 2 μg/mL Hoescht 33342 (blue channel), 500-times diluted Annexin V-FITC (green channel), and 1 μg/mL propidium iodide (red channel). High-content image acquisition and analysis are carried out. The program is set to take four images per well. The exposure time is set at 16.7 ms/10% gain, 500 ms/35% gain, and 300 ms/30% gain for the 4,6-diamidino-2-phenylindole, FITC, and rhodamine channels, respectively. Images are processed and the numbers of positive cells for each channel and each condition are determined. In addition, HT29 cells are treated with increasing concentrations of this compound for 32 hours in the absence or the presence of 25, 50, and 100 μM ZvAD-FMK (irreversible general caspase inhibitor), and the same procedures are undertaken. All experiments are done in triplicate. To determine whether the apoptotic effect is due to c-Met inhibition, the effect of this compound when glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and c-Met are knocked down using siRNA is investigated. HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are transfected with a nontargeted control siRNA, a gapgh-targeted control siRNA, or a met-targeted siRNA. After 3 days, c-Met, GAPDH, and β-actin expression levels are determined using specific antibodies. To determine if the effect is caspase dependent, HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are transfected with a met-targeted siRNA for 2 days and incubated in the absence or the presence of increasing concentrations of ZvAD-FMK for 1 additional day. A nontargeted siRNA and a gapgh-targeted siRNA (siRNA GAPDH) are also transfected in parallel, as controls. Cells are then stained with Annexin V-FITC and propidium iodide, and the percentage of apoptotic cells is determined.

• 동물 모델

  Female athymic nude mice bearing HT29, MKN-45, or MDA-MB-231 tumor xenografts

• 용량

  200 mg/kg

• 투여

  Orally administered