Crizotinib hydrochloride

PF-2341066은 mIMCD3 마우스 또는 MDCK 개 상피세포에서 c-Met 인산화에 대해 각각 5 nM 및 20 nM의 IC50으로 유사한 효능을 나타냅니다. PF-2341066은 c-Met ATP-결합 부위 돌연변이 V1092I 또는 H1094R 또는 P-루프 돌연변이 M1250T를 발현하도록 조작된 NIH3T3 세포에 대해 각각 19 nM, 2 nM 및 15 nM의 IC50으로 야생형 수용체를 발현하는 NIH3T3 세포의 IC50인 13 nM과 비교하여 개선되거나 유사한 활성을 보입니다. 대조적으로, c-Met 활성화 루프 돌연변이 Y1230C 및 Y1235D를 발현하도록 조작된 세포에 대해 PF-2341066의 효능에 현저한 변화가 관찰되며, 야생형 수용체와 비교하여 각각 127 nM 및 92 nM의 IC50을 보였습니다. PF-2341066은 또한 NCI-H69 및 HOP92 세포에서 c-Met의 인산화를 강력하게 방지하며, 각각 13 nM 및 16 nM의 IC50을 보였고, 이들 세포는 내인성 c-Met 변이체 R988C 및 T1010I를 각각 발현합니다. PF-2341066은 VEGFR2 및 PDGFRβ RTK에 대해 >1,000배, IRK 및 Lck에 대해 >250배, Tie2, TrkA 및 TrkB에 대해 ~40~60배 선택적이며, 모두 c-Met과 비교한 것입니다. PF-2341066은 RON 및 Axl RTK에 대해 20~30배 선택적입니다. 대조적으로, PF-2341066은 KARPAS299 인간 역형성 대세포 림프종(ALCL) 세포주에 의해 발현되는 ALK RTK의 뉴클레오포스민(NPM)-anaplastic lymphoma kinase (ALK) 발암성 융합 변이체에 대해 거의 동등한 24 nM의 IC50을 보입니다. PF-2341066은 암세포의 c-Met 의존성 신생물 표현형과 내피세포의 혈관신생 표현형을 억제합니다. PF-2341066은 인간 GTL-16 위암 세포 성장을 9.7 nM의 IC50으로 억제합니다. PF-2341066은 GTL-16 세포에서 8.4 nM의 IC50으로 세포자멸사를 유도합니다. PF-2341066은 HGF-자극된 인간 NCI-H441 폐암 세포 이동 및 침윤을 각각 11 nM 및 6.1 nM의 IC50으로 억제합니다. PF-2341066은 MDCK 세포 산란을 16 nM의 IC50으로 억제합니다. PF-2341066은 HGF-자극된 c-Met 인산화, 세포 생존 및 Matrigel 침윤을 각각 11 nM, 14 nM 및 35 nM의 IC50으로 방지합니다. 또한, PF-2341066은 혈청-자극된 HMVEC 분지형 관형성(혈관 형성)을 피브린 겔에서 방지합니다.[4]

GTL-16 모델에서 PF-2341066은 50 mg/kg/일 및 75 mg/kg/일 치료 코호트 모두에서 43일 투여 일정 동안 평균 종양 부피가 60% 감소하면서 대규모로 확립된 종양(>600 mm3)의 현저한 퇴행을 유발하는 능력을 보여줍니다. 또 다른 연구에서 PF-2341066은 50 mg/kg/일에서 3개월 치료 일정 동안 12마리 중 1마리만이 종양 성장률의 유의미한 증가를 보이며 GTL-16 종양 성장을 3개월 이상 완전히 억제하는 능력을 보여줍니다. NCI-H441 NSCLC 모델에서 38일 PF-2341066 투여 주기 동안 50 mg/kg/일에서 평균 종양 부피가 43% 감소하는 것이 관찰됩니다. Caki-1 RCC 모델에서 33일 PF-2341066 투여 주기 동안 50 mg/kg/일에서 각 종양의 부피가 최소 30% 감소하는 것과 관련된 평균 종양 부피의 53% 감소가 관찰됩니다. PF-2341066은 또한 U87MG 교모세포종 또는 PC-3 전립선암 이종이식 모델에서 50 mg/kg/일에서 확립된 종양 성장을 거의 완전히 방지하며, 연구 마지막 날 각각 97% 또는 84% 억제를 보입니다. 대조적으로, 50 mg/kg/일로 경구 투여된 PF-2341066은 MDA-MB-231 유방암 모델 또는 DLD-1 결장암 모델에서 종양 성장을 유의미하게 억제하지 않습니다. GTL-16 종양에서 12.5 mg/kg/일, 25 mg/kg/일 및 50 mg/kg/일에서 CD31 양성 내피세포의 유의미한 용량 의존적 감소가 관찰되며, 이는 MVD 억제가 항종양 효능과 용량 의존적 상관 관계를 보임을 나타냅니다. PF-2341066은 GTL-16 및 U87MG 모델 모두에서 인간 VEGFA 및 IL-8 혈장 수준의 유의미한 용량 의존적 감소를 보여줍니다. PF-2341066 경구 투여 후 GTL-16 종양에서 인산화된 c-Met, Akt, Erk, PLCλ1 및 STAT5 수준의 현저한 억제가 관찰됩니다.[4]

• 세포 키나아제 인산화 ELISA 분석

  세포는 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 배지에 96웰 플레이트에 시드되고 24시간 후 혈청 없는 배지 [0.04% 소 혈청 알부민(BSA) 함유]로 옮겨집니다. 리간드 의존성 RTK 인산화를 조사하는 실험에서는 해당 성장 인자가 최대 20분 동안 첨가됩니다. PF-2341066으로 세포를 1시간 동안 및/또는 지정된 시간 동안 적절한 리간드로 세포를 배양한 후, 세포는 1mM Na₃VO₄가 보충된 HBSS로 한 번 세척되고 세포에서 단백질 용해물이 생성됩니다. 이어서, 선택된 Protein Tyrosine Kinase의 인산화는 96웰 플레이트를 코팅하는 데 사용되는 특정 포획 항체와 인산화된 티로신 잔기에 특이적인 검출 항체를 사용하는 샌드위치 ELISA 방법으로 평가됩니다. 항체 코팅된 플레이트는 (a) 4°C에서 밤새 단백질 용해물 존재하에 배양되고; (b) 1% Tween 20이 포함된 PBS로 7회 세척되고; (c) 서양 고추냉이 과산화효소-접합된 항-총-인산화 티로신 (PY-20) 항체 (1:500)에 30분 동안 배양되고; (d) 다시 7회 세척되고; (e) 0.09 N H₂SO₄를 첨가하여 중단되는 비색 반응을 시작하기 위해 3,3′,5,5′-테트라메틸 벤지딘 과산화효소 기질에 배양되고; (f) 분광광도계를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정합니다.

• 세포주

  GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells

• 농도

  0-256 nM

• 배양 시간

  1 h

• 방법

  Cells including GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells are seeded in 96-well plates in media supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and transferred to serum-free media [with 0.04% bovine serum albumin (BSA)] after 24 hours. In experiments investigating ligand-dependent RTK phosphorylation, corresponding growth factors are added for up to 20 minutes. After incubation of cells with PF-2341066 for 1 hour and/or appropriate ligands for the designated times, cells are washed once with HBSS supplemented with 1 mM Na₃VO₄, and protein lysates are generated from cells. Subsequently, phosphorylation of selected protein kinases is assessed by a sandwich ELISA method using specific capture antibodies used to coat 96-well plates and a detection antibody specific for phosphorylated tyrosine residues. Antibody-coated plates are (a) incubated in the presence of protein lysates at 4 °C overnight; (b) washed seven times in 1% Tween 20 in PBS; (c) incubated in a horseradish peroxidase–conjugated anti–total-phosphotyrosine (PY-20) antibody (1:500) for 30 min; (d) washed seven times again; (e) incubated in 3,3^′,5,5^′-tetramethyl benzidine peroxidase substrate to initiate a colorimetric reaction that is stopped by adding 0.09 N H₂SO₄; and (f) measured for absorbance in 450 nm using a spectrophotometer.

• 동물 모델

  Female or male nu/nu mice bearing NCI-H441,or DLD-1, or MDA-MB-231

• 용량

  12.5 mg/kg/day, 25 mg/kg/day, and 50 mg/kg/day

• 투여

  p.o.