Cyclosporin A

Cyclosporin A는 T 세포의 사이클로필린(면역필린)에 결합하여[1] 이 복합체를 형성하여 calcineurin에 결합하고 억제합니다. [2] 이 화학물질은 7 nM의 IC50으로 calcineurin을 억제한 다음[3], NF-AT의 핵 전위를 차단합니다. [4] 또한 39 nM의 IC50으로 MTP(미토콘드리아 투과성 전환 pore)의 개방을 방지하여 미토콘드리아에도 영향을 미칩니다. [5]

Cyclosporin A는 쥐, 랫트 및 기니피그에게 비경구 또는 경구 투여 후 효과적인 면역억제제입니다. [6], 장기 이식에서 거부 반응을 예방하기 위해 임상적으로 사용됩니다. [7]

• phosphatase 분석

  정제된 소 뇌 calcineurin 및 칼모듈린을 구매합니다. 정제된 효소가 포함된 반응 혼합물은 20 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCI, 6 mM MgCl₂, 0.5 mM dithiothreitol, ml당 0.1 mg의 소 혈청 알부민, 그리고 0.1 mM CaCl₂ 또는 5 mM EGTA를 포함하는 60 μl (총 부피)의 분석 완충액에 100 nM calcineurin, 100 nM 칼모듈린, 5 μM ³²P-표지된 포스포펩타이드를 포함합니다. 세포 용해물이 포함된 반응 혼합물은 20 μl의 희석되지 않은 용해물, 5 μM ³²P-표지된 포스포펩타이드, 그리고 40 μl의 분석 완충액을 포함합니다. 표시된 경우, 반응 혼합물은 50 μM 펩타이드 412 또는 413 및/또는 500 nM 오카다이산(phosphatases 1 및 2A의 특정 억제제)을 포함합니다. 500 nM 오카다이산은 Ca²⁺-독립적 phosphatases의 억제에 충분하며, 더 높은 농도는 Ca²⁺-의존적 활성도 부분적으로 억제합니다. 30°C에서 15분 후, 5% 삼염화아세트산이 포함된 0.5 ml의 100 mM 인산칼륨 완충액 (pH 7.0)을 첨가하여 반응을 종료합니다. 유리 무기 인산염은 Dowex 양이온 교환 크로마토그래피로 분리하고 설명된 대로 섬광 계수로 정량합니다.

• 세포주

  Jurkat cells (clone J77)

• 농도

  ~100 nM

• 배양 시간

  1 hr

• 방법

  Immunosuppressive agents are dissolved in ethanol at concentrations 1000-fold more than the concentration desired for cell treatments. Cells (10⁶) are suspended in 1 ml of complete medium in microcentrifuge tubes; 1 μl of ethanol or of the ethanolic solution of Cyclosporin A is added, and the cells are incubated at 37°C for 1 hr. Cells are washed twice with 1 ml of PBS on ice and lysed in 50μl of hypotonic buffer containing 50 mM Tris (pH 7.5); 0.1 mM EGTA; 1 mM EDTA; 0.5 mM dithiothreitol; and 50 μg of phenylmethylsulfonyl fluoride, 50 μg of soybean trypsin inhibitor, 5 μg of leupeptin, and 5 μg of aprotinin per ml. Lysates are subjected to three cycles of freezing in liquid nitrogen followed by thawing at 30°C and then are centrifuged at 4°C for 10 min at 12,000×g.

• 동물 모델

  Rat

• 용량

  45 mg/kg

• 투여

  orally