Dyngo-4a (Hydroxy-Dynasore)

다이내민 I 활성은 SAI 활성 상태에서 측정하거나 세 가지 다른 방법으로 자극합니다. 각 자극이 다이내민을 다른 정도로 활성화하므로, 각 분석에는 다른 다이내민 농도가 필요합니다. 첫째, 최대 다이내민 활성은 초음파 처리된 PS 리포솜에 의해 자극됩니다. 정제된 다이내민 I (10–20 nM, 6 mM Tris–HCl, 20 mM NaCl 및 0.01% Tween 80, pH 7.4에 희석)을 96웰 플레이트에서 GTPase 완충액 (5 mM Tris–HCl, 10 mM NaCl, 2 mM Mg²⁺, 0.05% Tween 80, pH 7.4, 1 µg/mL 류펩틴 및 0.1 mM PMSF) 및 0.3 mM GTP와 함께 시험 화합물이 존재하는 상태에서 37°C에서 30분간 총 분석 부피 150 μL로 배양합니다. 반응은 10 μL의 0.5 M 에틸렌다이아민테트라아세트산 (EDTA) pH 7.4로 종료하고, 말라카이트 그린 용액 (40 μL: 2% w/v 몰리브덴산암모늄 테트라하이드레이트, 0.15% w/v 말라카이트 그린 및 4 M HCl)을 5분간 첨가합니다. 둘째, 다이내민 (20 nM)은 동일한 프로토콜을 사용하여 10 µg/mL의 탁솔 안정화된 형성된 소 뇌 미세소관에 의해 자극됩니다. 셋째, 다이내민 I (50 nM)은 재조합 grb2 1 μM에 의해 자극되는데, 이는 SH3 함유 단백질로, 리포솜이나 미세소관보다 약 5–10배 덜 효율적으로 다이내민을 자극합니다. 마지막으로, 다이내민 (500 nM) SAI 활성은 고농도의 다이내민을 사용하여 측정되며, 이는 고리 (나선형은 아님)로의 협동적 자가 조립을 촉진합니다. GTPase 또는 세포 내 이입 분석의 최종 DMSO 농도는 각각 최대 3.3% 또는 1%이지만, 일반적으로 1%입니다. 다이내민 I의 GTPase 분석은 DMSO가 최대 3.3%까지 영향을 미치지 않습니다. 화합물은 100% DMSO에 30 mM 스톡으로 용해됩니다. 이 스톡 용액은 –20°C에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다. 화합물은 이어서 20 mM Tris–HCl pH 7.4로 만든 50% DMSO 용액으로 희석하고 최종 분석에 다시 희석됩니다. 이 화합물 억제의 동역학 분석을 위해, 최종 농도 17 nM의 다이내민 I을 PS (2 µg/mL)와 다양한 양의 GTP (50–250 μM)를 포함하는 GTPase 완충액과 함께 0.5–6 μM 농도 범위의 이 화학 물질 존재 하에 배양합니다. 반응은 30분 후 EDTA (0.5 mM, pH 7.4) 첨가로 중단됩니다. 곡선은 Michaelis–Menten 방정식 v = Vmax[S]/(Km + [S])를 사용하여 생성되며, 여기서 S는 GTP 기질입니다. Vmax 및 Km 값이 결정된 후, 데이터는 Lineweaver–Burke 방정식 1/v = 1/Vmax + (Km/Vmax)(1/[S])를 사용하여 변환되었습니다. 분석 조건은 다이내민 I 분석을 기반으로 하지만 수정 사항이 포함되었습니다. 재조합 다이내민 II는 50 nM로 사용되었으며, 10 µg/mL PS에 의해 자극되었습니다. GTPase 반응은 종료 전에 37°C에서 90분 동안 진행되도록 허용되었습니다.

αT3–1 or LβT2 cells

30 μM

30 minutes

αT3-1 or LβT2 cells (2 × 10⁶) were grown overnight in a 6-well culture dish and then serum starved for 2–4 hours. Cells were pretreated with either vehicle (0), dynasore (80μM), or dyngo (30μM) for 30 minutes. For dose-response studies, indicated doses of this compound were used for a 30-minute pretreatment. After pretreatment, cells were treated with 0 or GnRHa (10 nM) for 10 minutes. Cells were then washed twice in PBS, lysed in radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer and subjected to SDS-PAGE (acrylamide:bis-acrylamide ratio of 29:1) and electroblotted to polyvinylidene difluoride membranes.

Female CD-1 mice

30 mg/kg

i.p.