Omipalisib (GSK2126458)

화합물은 Omipalisib (GSK2126458)에 대해 11가지 농도를 얻기 위해 384웰 폴리프로필렌 마더 플레이트의 1열부터 12열까지 그리고 13열부터 24열까지 3배 희석(100% DMSO)하여 연속적으로 희석됩니다. 6열과 18열에는 DMSO만 포함됩니다. 적정액이 만들어지면 0.05μL가 384웰 저용량 분석 플레이트로 옮겨집니다. 이 분석 플레이트에는 세 가지 약리학적 대조군(알려진 PI3K 억제제)과 세 가지 분석 대조군이 포함됩니다: (1) 억제제가 없는 효소; (2) 효소가 없는 완충액, 그리고 (3) 효소가 없는 완충액에 네이티브 PIP3가 추가된 것. DMSO는 6열과 18열의 모든 웰에 주입됩니다. PIP3는 18열의 번갈아 가며 있는 행(웰 18 B, D, F, H, J, L, N, P)에 1X 반응 완충액(200μM PIP3 1μL)에 40μM 농도로 첨가됩니다. 효소 없는 대조 반응은 웰 18 A, C, E, G, I, K, M, O(100% DMSO 0.1μL)에서 실행됩니다. PI3-Kinase 프로파일링 분석은 HTRF 키트를 사용하여 최적화됩니다. 분석 키트에는 7가지 시약이 포함됩니다: 1) 4X 반응 완충액; 2) 네이티브 PIP2(기질); 3) Stop A(EDTA); 4) Stop B(Biotin-PIP3); 5) 검출 믹스 A(스트렙타비딘-APC); 6) 검출 믹스 B(Eu-표지된 Anti-GST 및 GST-표지된 PH 도메인); 7) 검출 믹스 C(KF). PI3Kinase 반응 완충액은 스톡을 탈이온수와 1:4로 희석하여 준비됩니다. 사용 당일 새로 준비된 DTT는 최종 농도 5mM로 첨가됩니다. 효소 첨가 및 화합물 전배양은 Multidrop Combi를 사용하여 1X 반응 완충액에 PI3K 2.5μL(최종 농도의 두 배)를 모든 웰에 첨가함으로써 시작됩니다. 플레이트는 실온에서 15분 동안 배양됩니다. 반응은 Multidrop Combi를 사용하여 2X 기질 용액(PIP2 및 ATP를 1X 반응 완충액에) 2.5μL를 첨가함으로써 시작됩니다. 플레이트는 실온에서 1시간 동안 배양됩니다. 반응은 Multidrop Combi를 사용하여 정지 용액(Stop A와 Stop B를 각각 5:1 비율로 미리 혼합) 2.5μL를 모든 웰에 첨가함으로써 중단됩니다. 중단된 반응은 Multidrop Combi를 사용하여 검출 용액 2.5μL를 모든 웰에 첨가하여 제품 형성 검출을 위해 처리됩니다(검출 믹스 C, 검출 믹스 A, 검출 믹스 B를 18:1:1 비율로 혼합, 즉: 총 6000μL 부피의 경우 검출 믹스 C 5400μL, 검출 믹스 A 300μL, 검출 믹스 B 300μL를 혼합합니다. 참고: 이 용액은 사용 2시간 전에 준비해야 합니다). 암실에서 1시간 배양 후, HTRF 신호는 330nm 여기 및 620nm(Eu) 및 665nm(APC)의 이중 방출 검출로 설정된 Envision 플레이트 리더에서 측정됩니다.

BT474, HCC1954 and T-47D cells

0-1 μM

72 hours

BT474, HCC1954 and T-47D (human breast) are cultured in RPMI-1640 containing 10% fetal bovine serum at 37 °C in 5% CO₂ incubator. Cells are split into T75 flask two to three days prior to assay set up at density which yields approximately 70-80% confluence at time of harvest for assay. Cells are harvested using 0.25% trypsin-EDTA. Cell counts are performed on cell suspension using Trypan Blue exclusion staining. Cells are then plated in 384 well black flat bottom polystyrene in 48 μL of culture media per well at 1,000 cells/well. All plates are placed at 5% CO₂, 37 °C overnight and Omipalisib (GSK2126458) is added the following day. One plate is treated with CellTiter-Glo for a day 0 (t=0) measurement and read as described below. This compound is prepared in clear bottom polypropylene 384 well plates with consecutive two fold dilutions. 4 μL of these dilutions are added to 105 μL culture media, after mixing the solution, 2 μL of these dilutions are added into each well of the cell plates. The final concentration of DMSO in all wells is 0.15%. Cells are incubated at 37 °C, 5% CO₂ for 72 hours. Following 72 hours of incubation with it each plate is developed and read. CellTiter-Glo reagent is added to assay plates using a volume equivalent to the cell culture volume in the wells. Plates are shaken for approximately two minutes and incubated at room temperature for approximately 30 minutes and chemiluminescent signal is read on the Analyst GT reader. Results are expressed as a percent of the t=0 and plotted against the compound concentration. Cell growth inhibition is determined for this compound by fitting the dose response with a 4 or 6 parameter curve fit using XLfit software and determining the concentration that inhibits 50% of the cell growth (gIC50) with the Y min as the t=0 and Y max as the DMSO control. Value from wells with no cells is subtracted from all samples for background correction.

Human BT474 tumors implanted in mice.

≤300 μg /kg

Administered via p.o.