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생물학적 설명

특이성	HACE1 Antibody [A17B18]는 전체 HACE1 단백질의 내인성 수준을 인식합니다.
배경	HACE1(HECT 도메인 및 안키린 반복 서열 함유 E3 ubiquitin-protein ligase 1) 유전자는 6번 염색체에 위치하며 909개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화합니다. HACE1은 심장, 뇌, 태반, 췌장, 태아 및 성인 신장을 포함한 다양한 인체 조직에서 강하게 발현됩니다. HACE1 mRNA는 정상 인체 조직 전반에 걸쳐 유비쿼터스하게 발현됩니다. HACE1의 발현 수준 감소는 유전자 위치 상류에 위치한 두 개의 CpG 섬의 과메틸화와 강력하게 연관되어 있으며, 이는 후성 유전적 조절이 HACE1 침묵화에 중요한 역할을 함을 시사합니다. HACE1은 자연 살해/T-세포 림프종(NKTCL), 대장암, 위암을 포함한 여러 유형의 암에서 빈번하게 하향 조절됩니다. 세포 내에서 HACE1은 주로 소포체와 세포질에 국소화되지만, 일반적으로 내인성 단백질은 낮은 수준으로만 검출됩니다. 기능적으로 HACE1은 E3 Ligase 역할을 하며 E2 효소 UBCH7과 협력하여 표적 단백질의 유비퀴틴화를 촉매합니다. 특히 사이클린 D1의 인산화 의존적 분해에 관여하여 세포 주기 진행을 억제하는 역할을 합니다. HACE1은 또한 작은 GTPase Rac1의 활성형, GTP 결합형에 우선적으로 결합하여 그 폴리유비퀴틴화를 촉진합니다. 이 활성은 세포독성 괴사 인자 1(CNF1)에 대한 반응으로 Rac1 분해에 필수적이며, 내피 세포 단층의 세균 침입을 촉진하고, 선천 면역 방어 메커니즘에서 HACE1의 역할을 강조합니다. HACE1의 손실은 후기 발병 종양의 자발적 발생으로 이어져 종양 억제제로서의 기능을 더욱 뒷받침합니다. 이 유전자는 여러 인체 암에 연루된 핫스팟인 6q21 염색체 영역 내에 위치하며, 이는 종양 발생에서 임상적 중요성을 강조합니다.

특이성

HACE1 Antibody [A17B18]는 전체 HACE1 단백질의 내인성 수준을 인식합니다.

배경

HACE1(HECT 도메인 및 안키린 반복 서열 함유 E3 ubiquitin-protein ligase 1) 유전자는 6번 염색체에 위치하며 909개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화합니다. HACE1은 심장, 뇌, 태반, 췌장, 태아 및 성인 신장을 포함한 다양한 인체 조직에서 강하게 발현됩니다. HACE1 mRNA는 정상 인체 조직 전반에 걸쳐 유비쿼터스하게 발현됩니다. HACE1의 발현 수준 감소는 유전자 위치 상류에 위치한 두 개의 CpG 섬의 과메틸화와 강력하게 연관되어 있으며, 이는 후성 유전적 조절이 HACE1 침묵화에 중요한 역할을 함을 시사합니다. HACE1은 자연 살해/T-세포 림프종(NKTCL), 대장암, 위암을 포함한 여러 유형의 암에서 빈번하게 하향 조절됩니다. 세포 내에서 HACE1은 주로 소포체와 세포질에 국소화되지만, 일반적으로 내인성 단백질은 낮은 수준으로만 검출됩니다. 기능적으로 HACE1은 E3 Ligase 역할을 하며 E2 효소 UBCH7과 협력하여 표적 단백질의 유비퀴틴화를 촉매합니다. 특히 사이클린 D1의 인산화 의존적 분해에 관여하여 세포 주기 진행을 억제하는 역할을 합니다. HACE1은 또한 작은 GTPase Rac1의 활성형, GTP 결합형에 우선적으로 결합하여 그 폴리유비퀴틴화를 촉진합니다. 이 활성은 세포독성 괴사 인자 1(CNF1)에 대한 반응으로 Rac1 분해에 필수적이며, 내피 세포 단층의 세균 침입을 촉진하고, 선천 면역 방어 메커니즘에서 HACE1의 역할을 강조합니다. HACE1의 손실은 후기 발병 종양의 자발적 발생으로 이어져 종양 억제제로서의 기능을 더욱 뒷받침합니다. 이 유전자는 여러 인체 암에 연루된 핫스팟인 6q21 염색체 영역 내에 위치하며, 이는 종양 발생에서 임상적 중요성을 강조합니다.

사용 정보

응용

WB

희석

WB

1:1000 - 1:10000

반응성

Mouse, Rat, Human

출처

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

102 kDa

보관 완충액

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

보관
(수령일로부터)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

실험 방법
WB	Experimental Protocol: Sample preparation 1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature. 2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant; 5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration; 6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice. Electrophoretic separation 1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 5%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations 2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.) Transfer membrane 1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter; 2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer; 3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip"; 4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 120 min. ( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.) Block 1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes; 2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature; 3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time. Antibody incubation 1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:1000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight; 2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time; 3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour; 4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time. Antibody staining 1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly; 2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

실험 방법

WB

Experimental Protocol:

Sample preparation

1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature.

2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant;

5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration;

6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice.

Electrophoretic separation

1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 5%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations

2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.)

Transfer membrane

1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter;

2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer;

3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip";

4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications

Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 120 min.

( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.)

Block

1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes;

2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature;

3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time.

Antibody incubation

1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:1000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight;

2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time;

3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour;

4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time.

Antibody staining

1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly;

2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

참조

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34815381/
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38364733/

적용 데이터

WB

Selleck 검증

Lane 1: HEK293, Lane 2: SH-SY5Y, Lane 3: Mouse brain, Lane 4: Rat brain