JIB-04

활성 JMJD2E aa 1-350은 E.coli에서 정제되어 α-케토글루타레이트, 5-10 μM 철, 아스코르빈산 및 히스톤 펩타이드 기질 존재하에 NAD+가 보충된 포름알데히드 탈수소효소와의 연결 반응에서 NADH 생성을 정량화하거나 Epigentek kit P-3081을 사용하여 시험관 내에서 사용됩니다. Western 분석으로 정량화된 히스톤 탈메틸화 반응의 경우, Drs. Y. Shi와 J. Whetstine의 친절한 선물인 His-태그 hJMJ2D aa 1-350 발현 구조가 Qiagen Ni-NTA 아가로스 매뉴얼 지침 및 Whestine et al 54 프로토콜에 따라 E.coli에서 발현 및 정제됩니다. 간략하게, 단백질은 50 mM TrisHCl pH 7.8 + 0.3 M NaCl + 10% Glycerol + 200 mM immidazol에서 용출되고, 20 mM TrisHCl pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.2 mM PMSF, 0.5 mM DTT, 8% glycerol에 대해 투석됩니다. 효소는 분주되어 급속 냉동되고 -80°C에 보관됩니다. Western blot에 의한 활성 분석의 경우, ~1.5 μg의 효소가 0.3 μg H3K9me3 기질 (Active Motif #31213)과 10 μM (NH₄)₂Fe(SO₄)₂, 1 mM α-케토글루타레이트 및 2 mM sodium L-ascorbate를 포함하는 50 mM Hepes pH 7.9에서 용매 또는 약물 존재하에 결합되어 37°C에서 30분-2시간 동안 배양됩니다. SDS 로딩 버퍼가 반응에 추가되고, 끓인 후 샘플은 NuPage 4-12% Bis-Tris 젤에서 실행되고, 니트로셀룰로스로 전사되고 Upstate #07-523을 사용하여 블로팅되어 H3K9me3를 검출합니다. H3 총 신호 검출을 위해 Active Motif #39763 (1차) 및 IRDye 680 접합 당나귀 항토끼 IgG (2차, LI-COR # 926-32223)를 사용하고 Dr. M. Cobb가 친절히 제공한 Odyssey 적외선 영상 시스템에서 블롯을 이미지화했습니다. 시험관 내 IC50 결정 및 경쟁 연구의 경우, 일반적으로 100-200 ng의 정제된 단백질은 그림 범례에 표시된 대로 용매, JIB-04 또는 유사체와 함께 배양되고 ELISA로 활성이 측정됩니다 (H3K9me3 탈메틸화용 Epigentek kit P-3081, H3K4me3 탈메틸화용 P-3083, H3K27me3 탈메틸화용 P-3085). 반응액은 50mM Hepes pH 7.5, 0.01% Tween 20, 120nM (NH₄)₂Fe(SO₄)₂, 1 mM α-케토글루타레이트, 2 mM sodium L-ascorbate 및 50ng 펩타이드 기질을 포함합니다. 반응의 최종 효소 농도는 다음과 같았습니다: 206 nM JMJD2A, 12 nM JMJD2B, 60 nM JMJD2C, 90 nM JMJD2D E.coli, 30 nM JMJD2D Sf9, 30 nM JMJD2E, 30 nM Jarid1a, 35 nM JMJD3. 배경 판독값은 열 비활성화된 효소, 0.5-1 mM 2,4 PDCA 또는 2-OG가 없는 반응에서 제공됩니다. E.coli에서 정제된 hJMJD2A (aa1-350)는 Jose Rizo-Rey 박사의 친절한 선물이며, 본질적인 낮은 활성 때문에 400 ng/반응으로 분석됩니다. GraphPad Prism 소프트웨어는 IC50 계산 및 곡선 피팅에 사용됩니다. 우리가 정제한 E.coli JMJD2D와 BPS의 Sf9 JMJD2D는 구별할 수 없는 결과를 보였습니다. 기질 경쟁 분석의 경우, 분석의 선형 범위 내에 유지하고 ELISA 플레이트의 결합 용량을 포화시키지 않기 위해 > 0.75 μM H3K9me3를 포함하는 반응은 비생체물질화된 기질을 포함하거나 감지 단계에서 희석되고 신호는 희석 계수에 따라 조정됩니다. 세포 용해물에서 H3K9me3 탈메틸라제 활성의 직접적인 정량화를 위해, 처리된 세포 (10cm 접시에 2백만개 접종) 또는 PBS의 종양 균질액을 초음파 처리하고 (3x 4초) 동일한 양의 단백질을 보조 인자를 포함하는 반응 완충액에서 히스톤 H3K9me3 기질과 함께 37°C에서 2시간 동안 배양한 후 Epigentek kit P-3081 시약을 사용하여 H3K9me2 제품의 특정 면역 검출을 수행합니다. 40mM Tris pH 7.4, 100mM NaCl, 20% 글리세롤, 5mM β-메르캅토에탄올, 10mM 말토스에 있는 500 ng의 E.coli 정제 PHD2 단백질은 선형 범위 내에서 활성을 얻는 데 사용됩니다. HIF-1 ODD에서 유래한 생체물질화된 펩타이드 (Biotin-Acp-DLDLEALAPYIPADDDFQL 또는 Biotin-Acp-DLDLEALAP(OH)YIPADDDFQL 수산화된 대조군)는 Neutravidin 코팅된 96웰 플레이트에 고정됩니다. 효소는 표시된 약물의 존재하에 반응 완충액 (20 mM Tris-Cl pH 7.5, 5 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 0.12 μM 황산철, 0.5 mM 2-옥소글루타레이트 및 1 mM 아스코르베이트)에서 실온에서 45분 동안 코팅된 웰에서 배양됩니다. α-케토글루타레이트의 경쟁 유사체인 DMOG는 억제에 대한 양성 대조군으로 사용됩니다. 펩타이드 수산화는 수산화된 HIF 펩타이드 에피토프에 대해 생성된 다클론 토끼 항체 (자가 제조된 토끼 항-하이드록시프롤린 4817)를 사용하여 검출하고, 이어서 HRP 접합 염소 항토끼 2차 항체를 추가합니다. 발광은 EnVision 플레이트 리더에서 측정됩니다. LSD1 재조합 단백질의 활성은 제조업체 프로토콜에 따라 자체 억제제와 함께 Epigentek kit P-3075를 사용하여 측정됩니다.

Human lung cancer cell lines (LCa), primary or immortalized non-tumorigenic HBECs, prostate cancer (PCa), primary prostate stromal (PrSC) and prostate epithelial cells (PrEC).

~10 μM

96 hours

For cell viability assays, cells are plated at 1500-3000 cells/well in 96 well plates and treated the next day with increasing doses of this compound over 4 days and their viability assessed by standard MTS assays using Promega’s Cell Titer or Cell Titer-Glo reagents according to the manufacturer’s protocols. Absorbance at 490 nm and 650 nm or luminescence is measured by a Spectra Max or a FlouroStar Omega plate reader. Data are normalized to the untreated controls (100% viability). Each cell line is tested in 2-5 independent assays, each containing 4-8 replicates. IC50 values are calculated using DIVISA, a high-throughput software, developed in hous, for storing and analyzing drug sensitivity assays. Dose-response curves are plotted using a non-linear regression model and IC50s are determined from the fitted curves. The average IC50 derived from 2-5 independent assays, each containing 4-8 replicates is reported.

Mice harboring H358 xenografts or A549 xenografts

110 mg/kg (H358, i.p.), 55 mg/kg (A549, Oral gavage)

Oral gavage or i.p.