LDN-57444

분석을 시작하기 위해, 5 mg/mL 시험 화합물 0.5 μL(최종 반응 농도 약 50 μM) 또는 DMSO 대조군을 각 웰에 분주합니다. 효소와 기질은 UCH 반응 버퍼(50 mM Tris-HCl [pH 7.6], 0.5 mM EDTA, 5 mM DTT, 0.5 mg/mL 난백알부민)에 준비합니다. 그 다음, 기질 대조군 웰을 제외한 각 웰에 0.6 nM UCH-L1 25 μL를 첨가하고, 자동 쉐이커에서 45–60초 동안 플레이트를 흔들어줍니다. 효소/화합물 혼합물은 실온에서 30분 동안 배양한 후, 효소 반응을 시작하기 위해 200 nM Ub-AMC 25 μL를 첨가합니다. 반응 혼합물(300 pM UCH-L1, 100 nM Ubiquitin-AMC와 2.5 μg 시험 화합물)은 각 웰에 500 mM 아세트산 10 μL를 첨가하여 반응을 중단하기 전에 실온에서 30분 더 배양합니다. 형광 방출 강도는 쿠마린 필터 세트(ex = 365 nm, em = 450 nm)를 사용하는 LJL Analyst에서 측정되며, 효소 활성을 나타내기 위해 화합물의 고유 형광을 뺀 값입니다. DMSO 대조군(0.5 μL DMSO, 25 μL UCH-L1, 25 μL ubiquitine-AMC, 10 μL 아세트산), 효소 대조군(25 μL UCH-L1, 25 μL 버퍼, 10 μL 아세트산), 기질 대조군(25 μL 버퍼, 25 μL ubiquitine-AMC, 10 μL 아세트산), 억제제 대조군(0.5 μL ubiquitine 알데하이드 [100 nM 스톡], 25 μL UCH-L1, 25 μL ubiquitine-AMC, 10 μL 아세트산)도 각 분석 플레이트에서 수행하여 품질과 재현성을 보장합니다. 화합물이 대조군에 비해 60% 이상의 억제를 보인 경우 잠재적 UCH-L1 억제제로 선택됩니다. UCH-L1 효소 반응은 기본 로봇 지원 스크리닝에서 얻은 히트 화합물의 결과를 확인하기 위해 동일한 프로토콜을 사용하여 수동으로 두 번 반복됩니다.

H1299

~5 μM

24 h

MTT assay was performed to evaluate the cytotoxic effect of LDN-57444 (also known as ubiquitin aldehyde) on cancer cell lines. The results indicated that this compound significantly inhibited cell proliferation in a dose-dependent manner. Further analysis revealed that the inhibitory effect of this chemical was more pronounced in metastatic cells compared to primary tumor cells. Time-course experiments demonstrated sustained activity of the compound over 72 hours. Molecular docking studies suggested a high binding affinity between this chemical and the target protein. These findings highlight the potential of the compound as a therapeutic agent for targeted cancer therapy.