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생물학적 설명
| 특이성 | LYVE1 Antibody [C2N8]는 총 LYVE1 단백질의 내인성 수준을 검출합니다. |
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| 배경 | LYVE1(Lymphatic Vessel Endothelial Hyaluronan Receptor 1)은 림프관 내피세포에 주로 발현되는 제1형 막관통 당단백질이자 CD44 상동체입니다. 이는 N-말단 링크 모듈 히알루론산 결합 도메인(HABD)을 특징으로 하며, 이 도메인은 세 개의 이황화 결합(예: Cys84–Cys105)과 β4/β5 루프 잔기 Arg104 및 Lys107에 의해 안정화된 깊고 양전하를 띠는 홈을 형성하고, 이는 미끄럼 메커니즘을 통해 히알루론산(HA) 사슬을 움켜쥡니다. 이 도메인은 HABD 접근성을 조절하는 N- 및 O-결합 글리코실화 부위를 가진 고도로 글리코실화된 줄기로 둘러싸여 있으며, 그 뒤에는 막관통 나선과 짧은 세포질 꼬리가 있어 Cys201 및 Cys204의 이황화 결합을 통해 협동적 리간드 결합을 위한 동형이합체화를 가능하게 합니다. 휴지기 단량체 상태에서, 시알릴화된 글리칸은 HABD를 입체적으로 가립니다. 그러나 VEGF-C와 같은 염증성 자극은 뉴라미니다제 매개 탈시알릴화를 유도하여 고정된 HA 폴리머의 비환원 말단 도킹을 위한 결합 홈을 노출시킵니다. 이러한 HA 사슬은 각기 ~40 pN의 이탈력을 가지며, 인접한 LYVE1 수용체를 통해 직렬로 연결되며, 이는 물로 윤활되는 미끄럼 상호작용을 통해 가역적인 백혈구 주화성(haptotaxis)을 지원하고, 수지상 세포가 HA가 풍부한 당질층을 사용하여 림프 표면을 따라 이동하도록 합니다. 한편, LYVE1에 의한 가용성 HA 내재화는 짧은 세포질 꼬리 때문에 신호 전달 없이 간질 매트릭스를 재활용하여 체액 항상성을 유지합니다. 이 기계감응성 접착 메커니즘은 림프절로의 면역 세포 이동 및 림프관 신생, 그리고 조직 HA 제거의 기저를 이룹니다. 특히, LYVE1은 종양 관련 림프관에서 상향 조절되어 수지상 세포 및 종양 세포의 진입을 향상시켜 전이를 촉진하며, VEGFR3과 함께 공동 발현될 때 특히 그렇습니다. 반면, LYVE1 매개 HA 제거의 손상은 림프부종의 림프 기능 장애에 기여합니다. |
사용 정보
| 응용 | IHC, IF, FCM | 희석 |
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| 반응성 | Mouse | ||||
| 출처 | Rat Monoclonal Antibody | MW | |||
| 보관 완충액 | PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 | 보관 (수령일로부터) |
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years | ||
| IHC |
Experimental Protocol：
Deparaffinization/Rehydration
1. Deparaffinize/hydrate sections:
2. Incubate sections in three washes of xylene for 5 min each.
3. Incubate sections in two washes of 100% ethanol for 10 min each.
4. Incubate sections in two washes of 95% ethanol for 10 min each.
5. Wash sections two times in dH2O for 5 min each.
6.Antigen retrieval: For Citrate: Heat slides in a microwave submersed in 1X citrate unmasking solution until boiling is initiated; continue with 10 min at a sub-boiling temperature (95°-98°C). Cool slides on bench top for 30 min.
Staining
1. Wash sections in dH2O three times for 5 min each.
2. Incubate sections in 3% hydrogen peroxide for 10 min.
3. Wash sections in dH2O two times for 5 min each.
4. Wash sections in wash buffer for 5 min.
5. Block each section with 100–400 µl of blocking solution for 1 hr at room temperature.
6. Remove blocking solution and add 100–400 µl primary antibody diluent in to each section. Incubate overnight at 4°C.
7. Remove antibody solution and wash sections with wash buffer three times for 5 min each.
8. Cover section with 1–3 drops HRPas needed. Incubate in a humidified chamber for 30 min at room temperature.
9. Wash sections three times with wash buffer for 5 min each.
10. Add DAB Chromogen Concentrate to DAB Diluent and mix well before use.
11. Apply 100–400 µl DAB to each section and monitor closely. 1–10 min generally provides an acceptable staining intensity.
12. Immerse slides in dH2O.
13. If desired, counterstain sections with hematoxylin.
14. Wash sections in dH2O two times for 5 min each.
15. Dehydrate sections: Incubate sections in 95% ethanol two times for 10 sec each; Repeat in 100% ethanol, incubating sections two times for 10 sec each; Repeat in xylene, incubating sections two times for 10 sec each.
16. Mount sections with coverslips and mounting medium.
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| IF |
Experimental Protocol:
Sample Preparation
1. Adherent Cells: Place a clean, sterile coverslip in a culture dish. Once the cells grow to near confluence as a monolayer, remove the coverslip for further use.
2. Suspension Cells: Seed the cells onto a clean, sterile slide coated with poly-L-lysine.
3. Frozen Sections: Allow the slide to thaw at room temperature. Wash it with pure water or PBS for 2 times, 3 minutes each time.
4. Paraffin Sections: Deparaffinization and rehydration. Wash the slide with pure water or PBS for 3 times, 3 minutes each time. Then perform antigen retrieval.
Fixation
1. Fix the cell coverslips/spots or tissue sections at room temperature using a fixative such as 4% paraformaldehyde (4% PFA) for 10-15 minutes.
2. Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Permeabilization
1.Add a detergent such as 0.1–0.3% Triton X-100 to the sample and incubate at room temperature for 10–20 minutes.
(Note: This step is only required for intracellular antigens. For antigens expressed on the cell membrane, this step is unnecessary.)
Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Blocking
Add blocking solution and incubate at room temperature for at least 1 hour. (Common blocking solutions include: serum from the same source as the secondary antibody, BSA, or goat serum.)
Note: Ensure the sample remains moist during and after the blocking step to prevent drying, which can lead to high background.
Immunofluorescence Staining (Day 1)
1. Remove the blocking solution and add the diluted primary antibody.
2. Incubate the sample in a humidified chamber at 4°C overnight.
Immunofluorescence Staining (Day 2)
1. Remove the primary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
2. Add the diluted fluorescent secondary antibody and incubate in the dark at 4°C for 1–2 hours.
3. Remove the secondary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
4. Add diluted DAPI and incubate at room temperature in the dark for 5–10 minutes.
5. Wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
Mounting
1. Mount the sample with an anti-fade mounting medium.
2. Allow the slide to dry at room temperature overnight in the dark.
3. Store the slide in a slide storage box at 4°C, protected from light.
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참조
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