Necrostatin-1 (Nec-1)

Necrostatin-1 (1-100 μM)은 과발현된 및 내인성 RIP1의 자가인산화를 억제합니다. RIP1은 이 화합물의 괴사 세포 사멸 억제 활성에 책임이 있는 주요 세포 표적임이 밝혀졌습니다. [1]

이 화학 물질은 다양한 세포 유형에서 다양한 자극에 의해 유발되는 괴사 세포 사멸을 효율적으로 억제합니다. 이전에 괴사 세포 사멸의 저분자 억제제로 확인된 이 물질은 RIP kinase 유도 괴사 세포 사멸을 억제하고 Jurkat 세포에서 490 nM의 EC50으로 TNF-α 유도 괴사 세포 사멸을 억제합니다. [2]

Necrostatin-1 (Nec-1)은 수용체 상호작용 단백질 키나아제 1 (RIPK1)의 특정 저분자 억제제이며, 이 화합물의 인산화를 특이적으로 억제합니다.

• RIP1 키나아제 분석

  RIP1의 인산화는 키나아제 활성을 필요로 한다. FLAG가 표지된 야생형(WT) 또는 키나아제 비활성 점 돌연변이 RIP1(K45M)의 발현 벡터는 293T 세포에 형질감염되고, RIP1 키나아제 분석은 [γ-³²P]ATP 존재 하에 30℃에서 30분 동안 Methods에 기술된 대로 수행된다. 샘플은 SDS-PAGE에 로딩되고 RIP1 밴드는 자가방사선 사진으로 시각화된다. 방사성 밴드의 상대적 강도는 정량화되어 이 및 다른 모든 자가방사선 사진에 (비율로) 표시된다. 키나아제 반응과 병행하여, 비드 샘플은 항-RIP1 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 로딩되어 키나아제 반응에서 동등한 단백질 양을 보장한다.

• 세포주

  Jurkat, BALB/c 3T3, SV40-transformed MEF, L929

• 농도

  0.01-100 μM

• 배양 시간

  --

• 방법

  Cells are seeded in 96-well plates (white plates for luminescent assays; black plates for fluorescent assays; clear plates for MTT assay) at the density of 5,000-10,000 cells per well for adherent cells or 20,000-50,000 cells per well for suspension cells in 100 μl of the appropriate phenol red-free media. After incubation, we determined cell viability using one of the following methods. For the ATP assay, we used luminescence-based commercial kits and analyzed luminescence using a Wallac Victor II plate reader. For Sytox assay, we incubated cells with 1 μM Sytox Green reagent for 30 min at 37℃, and then performed fluorescent reading. Subsequently, we added 5 μl of 20% Triton X-100 solution into each well to produce maximal lysis and incubated cells for 1 h at 37℃, then performed the second reading. We calculated the ratio of values before and after Triton treatment and normalized it to the relevant controls not subjected to cytotoxic stimuli, as indicated in figure legends. For the MTT assay, we used the CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit. For PI exclusion assays, we added 2 μg/ml PI into the medium and immediately analyzed samples using FACSCalibur. For PI-annexin V assay we used the ApoAlert Annexin V-EGFP Apoptosis Kit. For DioC6 staining, we incubated cells with 40 nM DiOC₆ for 30 min at 37 ℃, washed once and analyzed in FACSCalibur. For ROS analysis, we incubated cells with 5 μM dihydroethidium for 30 min at 37 ℃, washed once and analyzed in FACSCalibur. EM analyses are performed at the Harvard Medical School EM facility. We acquired bright-field images of the cells using an Axiovert 200 microscope.

• 동물 모델

  Male C57BL/6 mice

• 용량

  0.0468 mg/Kg

• 투여

  i.a.