NMS-873

재조합 야생형 VCP 및 그 돌연변이의 ATPase 활성 및 동역학적 파라미터는 변형된 NADH-결합 분석법을 사용하여 반응에서 ADP 형성을 모니터링함으로써 평가됩니다. ADP와 NADH는 VCP ATPase 활성의 ATP 경쟁적 억제제이므로, NADH-결합 분석법의 표준 프로토콜은 두 단계 절차로 수정됩니다. 첫 번째 부분에서는 ATP 재생 시스템(40 U/ml 피루브산 키나아제 및 3 mM 포스포에놀피루브산)이 VCP 활성에 의해 생성된 ADP를 재활용하고, 기질 농도를 일정하게 유지하며(따라서 제품 억제를 방지함), 화학량론적 양의 피루브산을 축적합니다. 두 번째 부분에서는 VCP 효소 반응을 30 mM EDTA와 250 μM NADH로 퀜칭하고, 축적된 피루브산을 감소시키기 위해 40 U/ml 젖산 탈수소효소에 의해 화학량론적으로 산화됩니다. NADH 농도 감소는 Tecan Safire 2 리더 플레이트를 사용하여 340 nm에서 측정됩니다. 분석은 96 또는 384웰 UV 플레이트에서 50 mM Hepes, pH 7.5, 0.2 mg/mL BSA, 10 mM MgCl₂ 및 2 mM DTT를 포함하는 반응 버퍼에서 수행됩니다. 실험 데이터는 약 60 μM의 Ks*와 2.0 ± 0.1의 힐 계수(n)를 얻는 협동 방정식을 사용하여 피팅됩니다. HTS 캠페인은 1536웰 형식의 소형화된 분석법과 더 민감한 ADP 검출 시스템인 Transcreener ADP FP를 사용하여 100만 화합물 라이브러리에 대해 수행됩니다. 10 nM VCP와 10 μM 억제제의 20분 전배양을 수행한 후, 10 μM ATP를 반응에 추가하고, 퀜칭하기 전에 90분 동안 진행하도록 합니다. 스크리닝의 평균 Z'는 0.58이며, 3× s.d.(38% 억제)를 컷오프로 사용하는 히트율은 1.7%입니다. 10 μM 농도에서 60% 이상의 억제를 보이는 1차 히트는 물리화학적 및 구조적 필터를 사용하여 7,516개 화합물로 줄어듭니다. 최종적으로 3,988개의 1차 히트에 대해 이중으로 재확인을 수행하고, 이전에 설명된 NADH-변형 결합 분석법을 사용하여 용량-반응 평가를 위해 500개의 화합물을 선택합니다. 가장 흥미로운 HTS 히트의 효능은 야생형 VCP와 C522T 돌연변이 모두에 대해 측정됩니다. 각 효소에 대한 반최대 속도(Ks*)를 생성한 ATP 농도(야생형의 경우 60 μM, C522T 돌연변이의 경우 130 μM)가 분석에 사용됩니다. 가역적 억제제의 기질 농도 의존성을 탐색하기 위해, 포화 ATP 농도(1 mM)에서도 효능을 평가하고 표준 ATP 경쟁적 억제제(AMP-PNP)의 효능과 비교합니다.

A variety of hematological and solid tumor lines

~10 μM

72 hours

Cells are seeded at 1,600 cells per well in 384-well white clear-bottom plates. Twenty-four hours after seeding, cells are treated with the compounds (eight dilution points, in duplicate, for each compound) and incubated for an additional 72 h at 37 °C under a 5% CO₂ atmosphere. Cells are then lysed, and the ATP content in each well is determined using a thermostable firefly luciferase–based assay as a measure of cell viability. IC50 values are calculated using the percentage of growth of treated cells versus the untreated control.