Dacomitinib

PF299804는 ERBB 계열 키나아제의 특정 억제제입니다. 이 화합물은 EGFR 신호 전달을 억제하고 EGFR T790M을 포함하는 H3255 GR 세포주에서 apoptosis를 유도합니다. 이는 민감성 및 NSCLC 세포주에 효과적입니다. 이 화학 물질은 EGFR T790M을 발현하도록 조작된 H3255 및 HCC827 세포의 성장을 억제합니다. 이는 T790M 돌연변이 존재 시 EGFR 인산화를 억제합니다. [1] 이 약물은 ATP 부위에 결합하고 ERBB 계열 구성원의 촉매 도메인에 있는 친핵성 시스테인 잔기를 공유적으로 변형시켜 ERBB 티로신 키나아제 활성을 비가역적으로 억제하는 것으로 알려져 있습니다. [2] 이는 HER2 증폭 위암 세포(SNU216, N87)에서 상당한 성장 억제 효과를 보이며, BIBW-2992 및 CI-1033을 포함한 다른 EGFR 티로신 키나아제 억제제에 비해 50% 억제 농도 값이 낮습니다. 이 억제제는 apoptosis 및 G1 arrest를 유도하고 HER2 증폭 위암 세포에서 STAT3, AKT 및 세포외 신호 조절 키나아제(ERK)를 포함한 HER 계열 수용체 및 하위 신호 전달 경로의 인산화를 억제합니다. 또한 SNU216 세포에서 EGFR/HER2, HER2/HER3 및 HER3/HER4 헤테로다이머 형성뿐만 아니라 HER3과 p85 α의 결합을 차단합니다. [3] 최근 연구에서는 47개의 인간 유방암 및 불멸화된 유방 상피 세포주를 사용하여 이 화합물의 억제 효과를 평가했으며, 그 결과 HER-2 증폭 유방암 세포주의 성장을 비증폭 세포주보다 우선적으로 억제하는 것으로 나타났습니다(RR = 3.39, p < 0.0001). 이 화학 물질은 대부분의 민감성 세포주에서 HER2, EGFR, HER4, AKT 및 ERK의 인산화를 감소시킵니다. 이는 G0/G1 arrest와 apoptosis 유도를 결합하여 항증식 효과를 발휘합니다. [4]

경구 투여된 PF299804는 HCC827 Del/T790M 이종이식편의 성장을 효과적으로 억제합니다. [1] 이 화합물의 낮은 경구 투여(15mg/kg)는 ERBB 계열 구성원을 발현 및/또는 과발현하거나 ERBB1 (EGFR)에 이중 돌연변이(L858R/T790M)를 포함하는 다양한 인간 종양 이종이식 모델에서 현저한 종양 퇴행을 포함한 상당한 항종양 활성을 유발합니다. [2]

• ELISA 기반 ERBB 키나아제 분석

  ERBB1, ERBB2 및 ERBB4 세포질 융합 단백질은 PCR을 사용하여 ERBB1 서열(Met-668 ~ Ala-1211), ERBB2(Ile-675 ~ Val-1256) 및 ERBB4 서열(Gly-259 ~ Gly-690)을 바큘로바이러스 벡터 pFastBac에 클로닝하여 만들어집니다. 단백질은 바큘로바이러스에 감염된 Sf9 곤충 세포에서 GST 융합 단백질로 발현됩니다. 단백질은 글루타티온 세파로스 비드를 사용한 친화성 크로마토그래피로 정제됩니다. ERBB 티로신 키나아제 활성 억제는 ELISA 기반 수용체 티로신 키나아제 분석을 사용하여 평가됩니다. 키나아제 반응(50 mM HEPES, pH 7.4, 125 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 100 μM 오르토바나듐산 나트륨, 2 mM 디티오트레이톨, 20 μM ATP, 이 화합물 또는 운반체 대조군, 및 반응 혼합물 50 μL 당 1-5 nM GST-erbB)은 0.25 mg/mL 폴리-Glu-Tyr로 코팅된 96웰 플레이트에서 수행됩니다. 반응은 실온에서 6분 동안 흔들면서 배양됩니다. 키나아제 반응은 반응 혼합물을 제거하여 중단하고, 그 다음 웰은 세척 완충액(PBS 중 0.1% Tween 20)으로 세척됩니다. 인산화된 티로신 잔기는 HRP(양고추냉이 과산화효소)에 결합된 0.2 μg/mL 항인산화 티로신 항체(Oncogene Ab-4; 50 μL/웰)를 PBS에 3% BSA 및 0.05% Tween 20을 포함하여 희석하여 실온에서 25분 동안 흔들면서 첨가하여 검출됩니다. 항체는 제거되고 플레이트는 세척 완충액으로 세척됩니다. HRP 기질(SureBlue3,3 ,5,5-테트라메틸벤지딘 또는 TMB)이 추가되고(웰 당 50 μL) 실온에서 10-20분 동안 흔들면서 배양됩니다. TMB 반응은 50 μL의 정지 용액(0.09 N H₂SO₄)을 첨가하여 중단됩니다. 신호는 450 nm에서 흡광도를 측정하여 정량화됩니다. IC50 값은 중앙값 효과 방법을 사용하여 이 화합물에 대해 결정됩니다.

• 세포주

  Various NSCLC cell lines

• 농도

  0-20 nM

• 배양 시간

  72 hours

• 방법

  Growth and inhibition of growth is assessed by 5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) assay. This assay, a colorimetric method fordetermining the number of viable cells, is based on the bioreduction of MTS by cells to a formazan product that is soluble in cell culture medium, can be detected spectrophotometrically. The cells are exposed totreatment for 72 hours, and the number of cells used per experiment is determined empirically. All experimental points are set up in 6 to 12 wells, and all experiments are repeated at least thrice. The data are graphically displayed using GraphPad Prism version 3.00 for Windows (GraphPad Software). The curves are fitted using a nonlinear regression model with a sigmoidal dose response.

• 동물 모델

  HCC827-GFP or HCC827-Del/T790M lung cancer cells (in 0.2 mL of PBS) are inoculated s.c. into the lower-right quadrant of the flank of nude mice

• 용량

  10 mg/kg

• 투여

  Administered via oral gavage