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생물학적 설명

특이성	Phospho-Hsp27 (Ser82) Antibody [M1P19]는 Ser82에서 인산화되었을 때만 총 Phospho-HSP27 (Ser82) 단백질의 내인성 수준을 검출합니다.
배경	열충격 단백질 27 (HSP27)은 소형 열충격 단백질 (sHSP) 계열 (12–43 kDa)에 속하며 광범위한 세포 기능을 나타냅니다. 이는 분자 샤페론, 항산화제, 세포자멸사 조절자 및 액틴 세포골격 리모델링의 매개체 역할을 합니다. 다른 소형 HSP와 마찬가지로 HSP27은 C-말단 영역 내에 보존된 α-크리스탈린 도메인을 포함합니다. 산화 스트레스 하에서 HSP27은 글루타치온 생산을 향상시키고 유리 철 가용성을 감소시킴으로써 세포 내 활성 산소종 (ROS) 수준을 낮추어 세포를 보호합니다. 또한 미토콘드리아 의존성 및 독립성 세포자멸사 경로 모두에 영향을 미치는 강력한 항세포자멸사 활성을 나타냅니다. 예를 들어, HSP27은 Fas–FasL–매개 세포자멸사 동안 DAXX에 결합하여 DAXX가 ASK1과 결합하는 것을 방지합니다. 또한 Bax 및 사이토크롬 c와 상호작용하여 미토콘드리아 세포자멸사를 억제하고 카스파제 의존성 세포 사멸을 차단합니다. HSP27은 대부분의 세포 및 조직에서 기본 수준으로 발현되며, 일반적으로 큰 올리고머 복합체로 존재합니다. 스트레스에 노출되면 그 발현이 크게 증가하여 손상 조건에 대한 세포 저항성을 향상시킵니다. 이 단백질은 p38 MAPK 신호 경로의 하류에 있는 MAPKAP 키나제 2/3에 의해 매개되는 인간의 Ser15, Ser78 및 Ser82 (설치류에서는 Ser15 및 Ser86)에서 스트레스 유발 인산화를 겪습니다. 인산화는 올리고머 상태에 영향을 미칠 뿐만 아니라 파트너 단백질과의 상호작용도 조절합니다. 호중구에서 HSP27은 AKT 및 MAPKAP 키나제 2와 복합체를 형성하여 구성적 세포자멸사를 억제하고 염증 반응을 촉진합니다. HSP27의 스트레스 유발 인산화는 이 복합체를 파괴하여 AKT로부터의 해리 및 호중구 세포자멸사의 복원을 유도합니다. 특히, 인산화된 HSP27의 효과는 세포 유형 및 신호 환경에 따라 매우 상황 의존적입니다.

특이성

Phospho-Hsp27 (Ser82) Antibody [M1P19]는 Ser82에서 인산화되었을 때만 총 Phospho-HSP27 (Ser82) 단백질의 내인성 수준을 검출합니다.

배경

열충격 단백질 27 (HSP27)은 소형 열충격 단백질 (sHSP) 계열 (12–43 kDa)에 속하며 광범위한 세포 기능을 나타냅니다. 이는 분자 샤페론, 항산화제, 세포자멸사 조절자 및 액틴 세포골격 리모델링의 매개체 역할을 합니다. 다른 소형 HSP와 마찬가지로 HSP27은 C-말단 영역 내에 보존된 α-크리스탈린 도메인을 포함합니다. 산화 스트레스 하에서 HSP27은 글루타치온 생산을 향상시키고 유리 철 가용성을 감소시킴으로써 세포 내 활성 산소종 (ROS) 수준을 낮추어 세포를 보호합니다. 또한 미토콘드리아 의존성 및 독립성 세포자멸사 경로 모두에 영향을 미치는 강력한 항세포자멸사 활성을 나타냅니다. 예를 들어, HSP27은 Fas–FasL–매개 세포자멸사 동안 DAXX에 결합하여 DAXX가 ASK1과 결합하는 것을 방지합니다. 또한 Bax 및 사이토크롬 c와 상호작용하여 미토콘드리아 세포자멸사를 억제하고 카스파제 의존성 세포 사멸을 차단합니다. HSP27은 대부분의 세포 및 조직에서 기본 수준으로 발현되며, 일반적으로 큰 올리고머 복합체로 존재합니다. 스트레스에 노출되면 그 발현이 크게 증가하여 손상 조건에 대한 세포 저항성을 향상시킵니다. 이 단백질은 p38 MAPK 신호 경로의 하류에 있는 MAPKAP 키나제 2/3에 의해 매개되는 인간의 Ser15, Ser78 및 Ser82 (설치류에서는 Ser15 및 Ser86)에서 스트레스 유발 인산화를 겪습니다. 인산화는 올리고머 상태에 영향을 미칠 뿐만 아니라 파트너 단백질과의 상호작용도 조절합니다. 호중구에서 HSP27은 AKT 및 MAPKAP 키나제 2와 복합체를 형성하여 구성적 세포자멸사를 억제하고 염증 반응을 촉진합니다. HSP27의 스트레스 유발 인산화는 이 복합체를 파괴하여 AKT로부터의 해리 및 호중구 세포자멸사의 복원을 유도합니다. 특히, 인산화된 HSP27의 효과는 세포 유형 및 신호 환경에 따라 매우 상황 의존적입니다.

사용 정보

응용

WB, IP

희석

WB	IP
1:1000 - 1:2000	1:75

반응성

Mouse, Rat, Human

출처

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

23 kDa

보관 완충액

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

보관
(수령일로부터)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

실험 방법
WB	Experimental Protocol: Sample preparation 1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail, Phosphatase Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature. 2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail, Phosphatase Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail, Phosphatase Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant; 5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration; 6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice. Electrophoretic separation 1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 10%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations 2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.) Transfer membrane 1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter; 2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer; 3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip"; 4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 60 min. ( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.) Block 1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes; 2. Incubate the film in the blocking solution ( recommending 5% BSA solution) for 1 hour at room temperature; 3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time. Antibody incubation 1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:1000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight; 2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time; 3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour; 4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time. Antibody staining 1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly; 2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

실험 방법

WB

Experimental Protocol:

Sample preparation

1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail, Phosphatase Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature.

2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail, Phosphatase Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail, Phosphatase Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant;

5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration;

6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice.

Electrophoretic separation

1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 10%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations

2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.)

Transfer membrane

1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter;

2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer;

3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip";

4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications

Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 60 min.

( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.)

Block

1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes;

2. Incubate the film in the blocking solution ( recommending 5% BSA solution) for 1 hour at room temperature;

3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time.

Antibody incubation

1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:1000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight;

2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time;

3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour;

4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time.

Antibody staining

1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly;

2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

참조

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22564335/

적용 데이터

WB

Selleck 검증

Lane 1: HeLa (with 44°C heat shock), Lane 2: HeLa, Lane 3: Mouse heart, Lane 4: Rat heart