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생물학적 설명
| 특이성 | Poly/Mono-ADP Ribose Antibody [A22J18]는 ADP 리보실화된 단백질의 내인성 수준을 인식하며 다른 번역 후 변형과 교차 반응하지 않습니다. |
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| 배경 | 폴리(ADP-리보스) (PAR) 및 모노(ADP-리보스) (MAR)는 ADP-리보실전달효소, 특히 PARP (poly(ADP-ribose) polymerase) 계열 구성원에 의해 매개되는 가역적인 번역 후 변형입니다. MAR은 NAD⁺에서 전달된 단일 ADP-리보스 단위가 표적 단백질의 특정 아미노산 잔기(일반적으로 아스파르테이트, 글루타메이트 또는 라이신)에 공유 결합적으로 추가되는 것을 의미합니다. 대조적으로, PAR은 리보스-리보스 글리코사이드 결합을 통해 연결된 두 개 이상의 ADP-리보스 단위로 구성되어 선형 또는 분지형 사슬을 형성합니다. 구조적으로 각 ADP-리보스 단위는 약 0.5 kDa를 기여하며, 이는 PAR을 다양한 단백질 조립체를 지지할 수 있는 크고, 고도로 음전하를 띠며 유연한 고분자로 만듭니다. 가장 풍부하고 촉매 활성이 높은 핵 PARP인 PARP1은 DNA 가닥 파손 및 스트레스 신호에 의해 빠르게 활성화되어 PARylation을 촉매하여 DNA Damage/DNA Repair 복합체를 모집하고 조직합니다. MARylation과 PARylation은 서로 다른 세포 역할을 수행합니다. MAR은 종종 개별 단백질 활성 또는 상호작용을 조절하는 반면, PAR은 DNA Damage/DNA Repair, 염색질 리모델링, 스트레스 과립 형성, 유사분열 방추 조립 및 핵소체 무결성과 같은 과정에서 동적인 구조 요소로서 더 넓은 기능을 수행합니다. PARPs에 의한 합성 및 poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) 및 매크로도메인 가수분해효소와 같은 효소에 의한 분해 간의 균형은 세포 항상성을 유지하는 데 중요합니다. |
사용 정보
| 응용 | WB, IF | 희석 |
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| 반응성 | All | ||||||
| 출처 | Rabbit Monoclonal Antibody | MW | |||||
| 보관 완충액 | PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃ | 보관 (수령일로부터) |
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years | ||||
| IF |
Experimental Protocol：
Specimen Preparation
1. Aspirate liquid, then cover cells to a depth of 2–3 mm with 4% Paraformaldehyde diluted in 1X PBS.
NOTE: Paraformaldehyde is toxic, use only in a fume hood.
2. Fix cells for 15 min at room temperature.
3. Aspirate fixative, rinse three times in 1X PBS for 5 min each.
4. Proceed with Immunostaining.
Immunostaining
1. Add theblocking buffer and incubate for 60 min at RT.
2. Prepare primary antibody diluent in antibody dilution buffer as recommended .
3. Aspirate blocking solution, apply diluted primary antibody.
4. Incubate overnight at 4°C.
5. Rinse three times in 1X PBS for 5 min each.
6. Incubate specimens in fluorochrome-conjugated secondary antibody diluted in antibody dilution buffer for 1–2 hr at room temperature in the dark.
7. Rinse three times in 1X PBS for 5 min each.
8. Mount slides usingmounting medium with DAPI and cover with coverslips.
9. For best results, allow mountant to cure overnight at room temperature. For long-term storage, store slides flat at 59°C protected from light.
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| IF |
Experimental Protocol:
Sample Preparation
1. Adherent Cells: Place a clean, sterile coverslip in a culture dish. Once the cells grow to near confluence as a monolayer, remove the coverslip for further use.
2. Suspension Cells: Seed the cells onto a clean, sterile slide coated with poly-L-lysine.
3. Frozen Sections: Allow the slide to thaw at room temperature. Wash it with pure water or PBS for 2 times, 3 minutes each time.
4. Paraffin Sections: Deparaffinization and rehydration. Wash the slide with pure water or PBS for 3 times, 3 minutes each time. Then perform antigen retrieval.
Fixation
1. Fix the cell coverslips/spots or tissue sections at room temperature using a fixative such as 4% paraformaldehyde (4% PFA) for 10-15 minutes.
2. Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Permeabilization
1.Add a detergent such as 0.1–0.3% Triton X-100 to the sample and incubate at room temperature for 10–20 minutes.
(Note: This step is only required for intracellular antigens. For antigens expressed on the cell membrane, this step is unnecessary.)
Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Blocking
Add blocking solution and incubate at room temperature for at least 1 hour. (Common blocking solutions include: serum from the same source as the secondary antibody, BSA, or goat serum.)
Note: Ensure the sample remains moist during and after the blocking step to prevent drying, which can lead to high background.
Immunofluorescence Staining (Day 1)
1. Remove the blocking solution and add the diluted primary antibody.
2. Incubate the sample in a humidified chamber at 4°C overnight.
Immunofluorescence Staining (Day 2)
1. Remove the primary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
2. Add the diluted fluorescent secondary antibody and incubate in the dark at 4°C for 1–2 hours.
3. Remove the secondary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
4. Add diluted DAPI and incubate at room temperature in the dark for 5–10 minutes.
5. Wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
Mounting
1. Mount the sample with an anti-fade mounting medium.
2. Allow the slide to dry at room temperature overnight in the dark.
3. Store the slide in a slide storage box at 4°C, protected from light.
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참조
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