Rapamycin (Sirolimus)

Rapamycin은 HEK293 세포에서 내인성 mTOR 활성을 약 0.1 nM의 IC50로 억제하며, iRap와 AP21967의 IC50가 각각 약 5 nM과 약 10 nM인 것보다 더 강력합니다. [1] Saccharomyces cerevisiae에서 이 화합물 처리는 심각한 G1/S 세포 주기 정지 및 번역 개시 억제를 유도하여 대조군의 20% 미만 수준으로 만듭니다. [2] Rapamycin은 mTOR 신호 전달 억제 정도가 비슷함에도 불구하고 T98G 및 U87-MG의 세포 생존력을 용량 의존적으로 각각 2 nM 및 1 μM의 IC50로 유의하게 억제하는 반면, U373-MG 세포에 대해서는 25 μM 이상의 IC50로 거의 활성을 보이지 않습니다. 이 화학물질(100 nM)은 mTOR 기능을 억제하여 Rapamycin 민감성 U87-MG 및 T98G 세포에서 G1 정지 및 Autophagy를 유도하지만 세포자멸사는 유도하지 않습니다. [3]

생체 내 Rapamycin 처리는 p70S6K의 인산화 및 활성화, PHAS-1/4E-BP1에 의한 eIF4E 억제 해제와 같이 mTOR 하류에 있는 것으로 알려진 표적을 특이적으로 차단하여 족저근 무게 및 섬유 크기의 비대 증가를 완전히 차단합니다. [4] 이 화합물로 단기 치료 시, 심지어 0.16 mg/kg의 최저 용량에서도 p70S6K 활성의 심각한 억제를 유발하며, 이는 Eker 신장 종양의 종양 세포 사멸 및 괴사 증가와 관련이 있습니다. [5] 이 화학물질은 VEGF 생산 감소 및 VEGF 유도 내피 세포 신호 전달 차단을 통해 CT-26 이종이식 모델에서 전이성 종양 성장 및 혈관신생을 억제합니다. [6] 이 화합물을 4 mg/kg/일로 처리하면 C6 이종이식편의 종양 성장 및 종양 혈관 투과성을 유의하게 감소시킵니다. [7]

• mTOR 키나아제 분석을 위한 면역블로팅

  HEK293 세포는 12웰 플레이트의 웰당 2-2.5×10⁵개 세포로 플레이팅되고 DMEM에서 24시간 동안 혈청 결핍 상태로 배양됩니다. 세포는 Rapamycin (0.05-50 nM)의 증가하는 농도로 37 °C에서 15분 동안 처리됩니다. 혈청은 37 °C에서 30분 동안 최종 농도 20%로 첨가됩니다. 세포는 용해되고, 세포 용해물은 SDS-PAGE로 분리됩니다. 분리된 단백질은 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 전이되고, p70 S6 키나아제의 Thr-389에 대한 인산화 특이적 1차 항체로 면역블로팅됩니다. 데이터는 ImageQuant 및 KaleidaGr을 사용하여 분석됩니다.

• 세포주

  U87-MG, T98G, and U373-MG

• 농도

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~25 μM

• 배양 시간

  72 hours

• 방법

  Cells are exposed to various concentrations of Rapamycin for 72 hours. For the assessment of cell viability, cells are collected by trypsinization, stained with trypan blue, and the viable cells in each well are counted. For the determination of cell cycle, cells are trypsinized, fixed with 70% ethanol, and stained with propidium iodide using a flow cytometry reagent set. Samples are analyzed for DNA content using a FACScan flow cytometer and CellQuest software. For apoptosis detection, cells are stained with the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) technique using an ApopTag apoptosis detection kit. To detect the development of acidic vesicular organelles (AVO), cells are stained with acridine orange (1 μg/mL) for 15 minutes, and examined under a fluorescence microscope. To quantify the development of AVOs, cells are stained with acridine orange (1 μg/mL) for 15 minutes, removed from the plate with trypsin-EDTA, and analyzed using the FACScan flow cytometer and CellQuest software. To analyze the autophagic process, cells are incubated for 10 minutes with 0.05 mM monodansylcadaverine at 37 °C and are then observed under a fluorescence microscope.

• 동물 모델

  Athymic Nu/Nu mice inoculated subcutaneously with VEGF-A-expressing C6 rat glioma cells

• 용량

  ~4 mg/kg/day

• 투여

  Injection i.p.