Sorafenib (BAY 43-9006)

Raf-1 (잔기 305–648) 및 B-Raf (잔기 409–765)를 발현하는 재조합 바큘로바이러스는 융합 단백질로 정제됩니다. 전장 인간 MEK-1은 PCR에 의해 생성되고 Escherichia coli 용해물에서 융합 단백질로 정제됩니다. Sorafenib 토실레이트는 분석 완충액 [20 mM Tris (pH 8.2), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 및 0.15% β-메르캅토에탄올] 내의 Raf-1 (80 ng) 또는 B-Raf (80 ng)와 MEK-1 (1 μg) 혼합물에 최종 농도 1% DMSO로 첨가됩니다. Raf 키나아제 분석 (최종 부피 50 μL)은 25 μL의 10 μM γ[³³P]ATP (400 Ci/mol)를 첨가하여 시작되고 32 °C에서 25분 동안 배양됩니다. 인산화된 MEK-1은 포스포셀룰로스 매트 위에 여과하여 수확되고, 1% 인산이 비결합 방사능을 씻어내는 데 사용됩니다. 마이크로파 가열로 건조한 후, β-플레이트 카운터를 사용하여 필터에 결합된 방사능을 정량합니다. 인간 VEGFR2 (KDR) 키나아제 도메인은 Sf9 용해물에서 발현되고 정제됩니다. VEGFR2에 대한 시간 분해 형광 에너지 전달 분석은 시간 분해 형광 에너지 전달 형식의 96웰 불투명 플레이트에서 수행됩니다. 최종 반응 조건은 다음과 같습니다: 1 내지 10 μM ATP, 25 nM 폴리 GT-바이오틴, 2 nM 유로퓸 표지 인산화 (p)-Tyr 항체 (PY20), 10 nM APC, 1 내지 7 nM 세포질 키나아제 도메인 (최종 농도 1% DMSO, 50 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 0.1 mM EDTA, 0.015% Brij-35, 0.1 mg/mL BSA, 및 0.1% β-메르캅토에탄올). 반응 부피는 100 μL이며 효소 첨가로 시작됩니다. 플레이트는 반응 시작 후 약 1.5 내지 2.0시간에 Perkin-Elmer VictorV Multilabel 카운터에서 615 및 665 nM 모두에서 판독됩니다. 신호는 각 웰에 대해 비율: (665 nm/615 nM) × 10,000으로 계산됩니다. IC50 생성을 위해 이 화합물은 효소 시작 전에 첨가됩니다. 이 화합물을 50% DMSO/50% 증류수 용액에 1:3으로 연속 희석하여 50배 스톡 플레이트를 만듭니다. 이 화학물질의 최종 농도는 1% DMSO에서 10 μM 내지 4.56 nM입니다.

MDA-MB-231, and HAoSMC

Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

72 hours

Cells are exposed to increasing concentrations of Sorafenib tosylate for 72 hours. Cell number is quantitated using the Cell TiterGlo ATP Luminescent assay kit. This assay measures the number of viable cells per well by measurement of luminescent signal based on amount of cellular ATP.

Female NCr-nu/nu mice implanted s.c. with MDA-MB-231, Colo-205, HT-29, H460, or A549 cells

~60 mg/kg

Orally once daily