SP-96

SP-96은 Aurora B 효소 분석에서 서브 나노몰 농도 효능(IC50 = 0.316 ± 0.031 nM)을 보입니다. 이 화합물은 정상 조혈에 중요한 FLT3 및 KIT에 대해 >2000배의 선택성을 보입니다. 이 억제제의 효소 역학은 비-ATP 경쟁적 억제를 보여주며, 이는 최초의 억제제입니다. NCI60 스크리닝에서 선택적 성장 억제를 보이며, 삼중 음성 유방암 세포주인 MDA-MD-468의 억제를 포함합니다.[1]

• Aurora Kinase B 효소 분석

  키나아제 억제 분석은 미세유체 분석에서 키나아제 활성을 측정하여 수행됩니다. 인산화된 생성물과 기질의 분리가 모니터링됩니다. 분석은 Caliper EZ Reader II에서 12-시퍼 칩을 사용하여 실행됩니다. 분리 완충액에 사용된 레시피는 100 mM HEPES, 10 mM EDTA, 0.015% Brij-35, 0.1% CR-3입니다. 화합물 스톡(DMSO에 20 mM)은 키나아제 완충액에 희석됩니다. 원하는 스톡 용액 1 μL가 384웰 마이크로타이터 분석 플레이트로 옮겨집니다. Aurora B 효소는 키나아제 완충액에 2 nM 농도로 희석됩니다. 효소 혼합물 5 μL가 분석 플레이트로 옮겨집니다. 억제제/Aurora B 효소는 약하게 흔들면서 60분 동안 배양됩니다. ATP와 위에 설명된 키나아제 완충액에 용해된 5FAM 태그가 붙은 펩타이드를 포함하는 기질 혼합물이 준비됩니다. 기질 용액 5 μL가 분석 플레이트에 추가됩니다. 실행 농도는 다음과 같습니다: 펩타이드 (1.5 μM), ATP (190 μM), 그리고 이 화합물 12점 ½log 희석 (0.2 mM-0.632 nM). 양성 대조군에는 억제제가 추가되지 않았고, 음성 대조군에는 효소가 추가되지 않았습니다. 실행 대조군에는 바라세르팁이 사용됩니다. 억제율은 시작 펩타이드와 인산화된 생성물 피크를 비교하여 측정됩니다.

• 세포주

  MCF-7 cells

• 농도

  --

• 배양 시간

  24 h

• 방법

  The growth inhibition of 60 cell lines is obtained by submitting the compound to National Cancer Institute’s NCI60 panel. MCF-7 cells are cultured in RPMI-1640 medium with 5% FBS in an incubator maintained at 37 ℃ and 5% CO2. The media is changed on alternate days. After reaching confluency, the media is aspirated, cells are washed with PBS, detached using 0.25% trypsin and centrifuged. The collected cells are seeded in 96-well microtiter plates at a density of 5000 cells/well. The cells are allowed to adhere to plate overnight. The test compounds, vehicle control and positive controls are added 24 h after the cells are plated and allowed to incubate. Following 24 h of incubation, the media is aspirated, and the cells are washed with PBS. 40 mL of the media and 10 mL of 5 mg/mL of MTT solution prepared in PBS is added to the cells and incubated for 4 h at 37 ℃ and 5% CO2. After incubation, 150 mL of DMSO is added to each well and the cell viability is measured at 570 nM by an ELISA plate reader.