Sulforhodamine B sodium salt

세포 배양에서 Sulforhodamine B 비색 분석을 통한 세포 증식 분석
1. 96웰 플레이트(복제당 50 μl) 또는 384웰 플레이트(복제당 10 μl)에서 삼중 또는 육중 복제에 충분한 양의 처리 용액을 준비합니다. 피펫팅 편차를 고려하여 볼륨을 확보하십시오.
2. 처리 용액은 수용액(예: 트랜스펙션을 위한 Opti-MEM) 또는 적합한 용매(예: DMSO)로 준비할 수 있습니다.
3. 세포 단층에서 배지를 제거하고 멸균 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 1ml(100mm 플레이트의 경우)의 0.25% 트립신을 추가하여 세포 성장 표면을 고르게 덮습니다.
4. 37 °C에서 5분 동안 또는 세포가 분리되기 시작할 때까지 배양합니다. FBS가 포함된 배양 배지 10배량으로 트립신을 비활성화합니다. 균질한 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 위아래로 섞습니다.
5. 세포 현탁액을 멸균 Falcon 튜브로 옮깁니다.
6. 혈액 세포 계산 챔버를 사용하여 세포 현탁액과 0.4% 트립판 블루 용액의 1:1 혼합물로 세포 농도를 결정합니다. 선택적으로, 계수 전에 세포를 원심 분리하여 트립신을 씻어내고 성장 배지에 재현탁합니다.
7. 각 웰에 적절한 세포 파종 밀도를 위해 성장 배지(10% FBS)로 세포 농도를 조정합니다.
8. 처리 용액을 혼합하고 각 웰에 50 μl (96웰 형식) 또는 10 μl (384웰 형식)을 분주합니다.
9. 세포 현탁액을 철저히 혼합하고 처리 용액이 있는 각 웰에 50 μl (96웰 형식) 또는 10 μl (384웰 형식)을 추가합니다.
참고: 웰 바닥에 세포가 고르게 분포되도록 하고, '링 효과'를 방지하기 위해 흔들지 마십시오.
10. 미처리 또는 비히클 대조군을 위한 세 개의 웰과 배경 차감(background subtraction)을 위한 세 개의 웰을 따로 두고, 판독 준비가 될 때까지 37 °C에서 5% CO2와 함께 플레이트를 배양합니다.
11. 차가운 50% TCA 25 μl (96웰 형식) 또는 5 μl (384웰 형식)을 배지 상등액에 직접 추가합니다. 플레이트를 4 °C에서 1시간 동안 혼합 없이 배양합니다.
12. 느리게 흐르는 수돗물에 담가 플레이트를 네 번 세척하고, 여분의 물은 종이 타월에 두드려 제거합니다. 플레이트를 실온에서 공기 건조시킵니다.
13. 각 웰에 50 μl (96웰 형식) 또는 20 μl (384웰 형식)의 0.04% SRB 용액을 추가합니다.
14. 실온에서 1시간 동안 배양하고 1% 아세트산(96웰 형식의 경우 200 μl 또는 384웰 형식의 경우 30 μl)으로 플레이트를 네 번 헹굽니다. 플레이트를 실온에서 공기 건조시킵니다.
15. 각 웰에 50 μl에서 100 μl의 10mM 트리스 염기 용액(pH 10.5)을 추가하고 궤도 셰이커에서 10분 동안 플레이트를 흔들어 단백질 결합 염료를 용해시킵니다.
16. 마이크로플레이트 리더에서 510nm에서 흡광도를 측정합니다.