Ulixertinib (BVD-523)

MEK U911-활성화된 ERK2 단백질은 사내에서 발현 및 정제됩니다. 효소 및 기질 용액은 50 mM Tris (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 0.1 mM EGTA, 10 mM DTT 및 0.01% (v/v) CHAPS로 구성된 분석 완충액에 만들어집니다. 1.2 nM ERK2 단백질은 분석 완충액에 준비되고, Ulixertinib (BVD-523)를 포함한 테스트 및 참조 대조 화합물이 들어있는 폴리프로필렌 384웰 플레이트의 각 웰에 10 µL가 분주됩니다. 화합물 플레이트는 이전에 100 µM에서 0.1 nM까지 12점 범위로 도세되어 IC50을 계산했으며, 분석에서 총 DMSO 농도는 1%였습니다. 실온에서 효소와 화합물의 20분 전 배양 후, 16 µM Erktide (IPTTPITTTYFFFK) 및 120 µM ATP (측정된 Km)로 구성된 10 µL의 기질 용액이 분석 완충액에 첨가됩니다. 반응은 실온에서 20분 동안 진행되도록 허용된 후 80 µl의 1% (v/v) 포름산 첨가로 억제됩니다. 분석 플레이트는 RapidFire 질량 분석 플랫폼에서 실행되어 기질 (비인산화 Erktide) 및 생성물 (인산화 Erktide) 수준을 측정합니다.

A375 cells

~30 μM

72 h

A375 cells are cultured in cell media composed of DMEM, 10% (v/v) Foetal Calf Serum and 1% (v/v) L-Glutamine. After harvesting, cells are dispensed into black, 384-well Costar plates to give 200 cells per well in a total volume of 40 µL cell media, and are incubated overnight at 37°C, 90% relative humidity and 5% CO₂ in a rotating incubator. Ulixertinib (BVD-523), test compounds and reference controls are dosed directly into the cell plates, into the inner 308 wells, using a Labcyte Echo 555 acoustic dispenser. The cells are dosed over a 12 point range from 30 µM down to 0.03 nM in order to calculate compound IC50s, with a total DMSO concentration in the assay of 0.3%. The cell plates are then incubated for 72 hours at 37°C. Cells were fixed and stained by the addition of 20 µL 12% formaldehyde in PBS/A (4% final concentration) and 1:2000 dilution of Hoechst 33342, with a 30 minute room temperature incubation, and then washed with PBS/A. A cell count is performed on the stained cell plates using a Cellomics ArrayScanTM VTI imaging platform. A Day 0 cell plate is also fixed, stained and read to generate a cell count baseline for determining compound cytotoxic effects as well as anti-proliferative effects.