UNC1999

메틸전달효소 활성 분석은 PRC2-EZH2 삼량체 복합체 (EZH2:EED:SUZ12), PRC2-EZH1 오량체 복합체 (EZH1:EED:SUZ12:RBBP4:AEBP2), SETD7, G9a, GLP, SETDB1, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, SUV39H2, MLL1 사량체 복합체 (MLL:WDR5:RbBP5:ASH2L), PRMT1, PRMT3, PRMT5-MEP50 복합체 및 SMYD2에 대한 섬광 근접 분석(SPA)을 사용하여 S-아데노실메티오닌 (3H-SAM)으로부터 생체 표지된 펩타이드 기질로 삼중수소 표지된 메틸 그룹의 통합을 모니터링하여 수행됩니다. SMYD2 및 SMYD3에 대한 반응 완충액은 50 mM Tris pH 9.0, 5 mM DTT, 0.01% TritonX-100; G9a, GLP 및 SUV39H2에 대한 반응 완충액은 25 mM 인산칼륨 pH 8.0, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl₂ 및 0.01% Triton X-100; 다른 HMT에 대한 반응 완충액은 20 mM Tris pH 8.0, 5 mM DTT, 0.01% TritonX-100입니다. 효소 반응을 중지시키기 위해 10 μL의 7.5 M 염산 구아니딘을 첨가하고, 이어서 180 μL의 완충액을 첨가하고 혼합한 후 384웰 FlashPlate로 옮깁니다. 혼합 후, 반응 혼합물을 인큐베이션하고 Topcount 플레이트 리더를 사용하여 CPM 수를 측정합니다. 각 데이터 세트에서 이 화합물이 없을 때의 CPM 수는 100% 활성으로 정의됩니다. 효소가 없을 때, 각 데이터 세트의 CPM 수는 배경 (0%)으로 정의됩니다. IC50 값은 100 nM에서 100 μM 범위의 화합물 농도를 사용하여 결정됩니다. IC50 값은 SigmaPlot 소프트웨어를 사용하여 결정됩니다. EZH2-Y641F 분석은 20 mM Tris pH 8, 5 mM DTT, 0.01% Triton X-100, 5 μM SAM 및 1 μM H3 (1-24) 펩타이드 (야생형 PRC2-EZH2 복합체와 동일)에서 30 nM 효소를 사용하여 수행됩니다. DNMT1의 경우, 분석은 헤미메틸화된 dsDNA를 기질로 사용하여 수행됩니다. dsDNA 기질은 Eurofins MWG Operon에서 합성한 두 개의 상보적 가닥 (생체 표지된 순방향 가닥: BGAGCCCGTAAGCCCGTTCAGGTCG 및 역방향 가닥: CGACCTGAACGGGCTTACGGGCTC)을 어닐링하여 준비됩니다. 반응 완충액은 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5mM DTT, 0.01% Triton X-100입니다. DOT1L에 대한 메틸전달효소 활성 분석은 필터 플레이트를 사용하여 수행됩니다. 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM DTT, 2 mM MgCl₂ 및 0.01% Triton X-100의 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 100 μL의 10% TCA를 첨가하고 혼합한 후 필터 플레이트로 옮깁니다. 플레이트는 2분 동안 2000 rpm으로 원심분리한 후 2번의 추가 10% TCA 세척과 한 번의 에탄올 세척 (180 μL)을 거쳐 원심분리합니다. 플레이트를 건조하고 100 μL의 MicroO를 첨가하고 원심분리합니다. 70 μL의 MicroO를 첨가하고 Topcount 플레이트 리더를 사용하여 CPM을 측정합니다.

DLBCL cell line harboring the EZH2Y641N mutant

~5 μM

8 days

DB cells, a diffuse-large B-cell lymphoma cell line harboring the EZH2 Y641N mutation, are obtained from ATCC and cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum, antibiotics, and various concentrations of compounds (DMSO control, UNC1999, or UNC2400). The medium containing the test compound or control is refreshed every 3 days. The numbers of viable cells from at least three independent experiments are measured using TC20 automated cell counter system. Total histones are prepared from cell nuclei using an acidic extraction protocol. About 1 μg of total histones is separated using 15% SDS-PAGE, transferred to PVDF membranes, and probed with histone antibodies. Antibodies used in this study are those against EZH2, general H3, and H3K27me3.

Male Swiss albino mice

~150 mg/kg (i.p.), ~50 mg/kg (oral)

Intraperitoneal administration or oral administration