KW-2449 FLT3 inhibiteur

Investigated as a FLT3 inhibitor in clinical trials, with others in early development.

Le KW-2449, un inhibiteur multikinase de FLT3, ABL, ABL-T315I et Aurora kinase, est en cours d'étude pour traiter les patients atteints de leucémie. Ce composé présente des effets inhibiteurs de croissance puissants sur les cellules leucémiques avec des mutations FLT3 par inhibition de la FLT3 kinase, entraînant la régulation à la baisse du FLT3/STAT5 phosphorylé, un arrêt en G1 et l'apoptose. L'administration orale de cette substance chimique montre une inhibition dose-dépendante et significative de la croissance tumorale dans un modèle de xénogreffe muté FLT3 avec une suppression minimale de la moelle osseuse. Dans la leucémie humaine de type sauvage FLT3, il induit la réduction de l'histone H3 phosphorylée, l'arrêt en G2/M et l'apoptose. Dans la leucémie résistante à l'Imatinib, cet agent contribue à la libération de la résistance par la régulation à la baisse simultanée des kinases BCR/ABL et Aurora. L'activité inhibitrice de ce composé n'est pas affectée par la présence de protéines plasmatiques humaines, telles que l'α1-glycoprotéine acide. Il possède de puissantes activités inhibitrices de croissance contre divers types de leucémie par plusieurs mécanismes d'action. Cet inhibiteur a une activité significative et justifie une étude clinique chez les patients atteints de leucémie avec des mutations FLT3 ainsi que des mutations résistantes à l'Imatinib. Les niveaux de phosphorylation de FLT3 et STAT5 sont diminués par cette substance chimique de manière dose-dépendante. De plus, il inhibe puissamment ABL-T315I, qui est associé à la résistance à l'IM, avec une IC50 de 4 nM. D'autre part, ce composé a peu d'effet sur PDGFRβ, IGF-1R, EGFR et diverses sérine/thréonine kinases, même à une concentration de 1 μM. Il a des activités inhibitrices de croissance puissantes non seulement contre les cellules leucémiques exprimant FLT3/ITD, mais aussi contre les cellules leucémiques activées par FLT3/KDM et sur-exprimant le FLT3 de type sauvage. Conformément à l'effet inhibiteur de croissance, cet agent supprime les phosphorylations de FLT3 (P-FLT3) et de sa molécule en aval phospho-STAT5 (P-STAT5) dans les cellules MOLM-13 de manière dose-dépendante. En outre, il augmente le pourcentage de cellules en phase G1 du cycle cellulaire et réduit réciproquement le pourcentage de cellules en phase S, ce qui entraîne une augmentation de la population de cellules apoptotiques. Ce composé peut déphosphoryler la kinase WT-FLT3 constitutivement active, mais n'inhibe pas la prolifération des cellules leucémiques si elles ne sont pas principalement dépendantes de la kinase FLT3. [1] Il est rapidement absorbé et converti en un métabolite majeur M1. Des études précliniques révèlent que cette substance chimique est convertie par la monoamine oxydase-B (MAO-B) et l'aldéhyde oxydase en son métabolite majeur M1. Cet agent médie la cytotoxicité par l'inhibition de FLT3/ITD. C'est un inhibiteur direct de FLT3 et il induit l'inhibition de sa cible en aval STAT5. [2] Ce composé interagit de manière synergique avec les HDACIs pour induire l'apoptose dans les cellules CML Ph+ de manière dépendante du temps et de la concentration. Il améliore de manière synergique la létalité du vorinostat/SNDX275 dans les cellules CML. Ces régimes d'inhibiteurs sont actifs contre les cellules leucémiques Bcr/Abl⁺ résistantes à l'IM supplémentaires. Il réduit modérément la phosphorylation de l'histone H3, un indicateur de l'activité d'Aurora B, dans les cellules K562 traitées au nocodazole. [3]

Phosphorylation de FLT3

Les cellules leucémiques sont lavées dans du tampon phosphate salin (PBS), puis lysées en remettant les cellules en suspension dans un tampon de lyse (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 % Igepal, 1 mM EDTA, 2 mM NaVO₄, plus l'inhibiteur de protéase complet KW-2449 pendant 30 minutes sous agitation. L'extrait est clarifié par centrifugation à 1,6 × 10⁴ g et le surnageant est analysé pour les protéines (Bio-Rad). Une aliquote de 50 μg est prélevée comme lysat cellulaire entier pour l'analyse de STAT5, et le reste est utilisé pour l'immunoprécipitation avec anti-FLT3. L'anticorps anti-FLT3 est ajouté à l'extrait pour une incubation d'une nuit, puis la protéine A sépharose est ajoutée pendant 2 heures supplémentaires. Des gels d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) séparés pour le lysat cellulaire entier et les immunoprécipités sont exécutés en parallèle. Après transfert sur des membranes Immobilon, l'immunoblotting est effectué avec un anticorps antiphosphotyrosine (4G10) pour détecter le FLT3 phosphorylé ou, pour les gels de lysat cellulaire entier, avec un anticorps monoclonal de rat contre le STAT5 phosphorylé (résidu Y694) puis décapé et ré-sondé avec l'anticorps anti-FLT3 pour mesurer le FLT3 total. Les protéines sont visualisées par chimioluminescence, exposées sur un film Kodak BioMax XAR, développées et scannées à l'aide d'un densitomètre Bio-Rad GS800. La concentration de ce composé pour laquelle la phosphorylation de FLT3 ou STAT5 est inhibée à 50 % de sa valeur de base (IC50) est déterminée à l'aide d'une analyse de régression linéaire des courbes dose-réponse. Pour l'analyse directe de FLT3 et STAT5 dans les blastes circulants, le sang périphérique est recueilli dans des tubes héparinés et rapidement refroidi sur glace. Les échantillons sont centrifugés pendant 10 minutes à 900 g, à 4 °C. Le plasma est retiré et stocké congelé à −80 °C. La couche leucocytaire est soigneusement transférée dans du PBS glacé, superposée sur du Ficoll-Hypaque refroidi, et centrifugée pendant 5 minutes à 600 g, à 4 °C. Toutes les étapes ultérieures sont effectuées à 4 °C. Les cellules mononucléées sont collectées et lavées rapidement une fois dans un tampon de lyse des globules rouges (0,155 M NH₄Cl, 0,01 M KHCO₃, 0,1 mM EDTA), puis lavées une fois dans du PBS. Les cellules sont ensuite lysées comme décrit pour l'analyse de FLT3 et STAT5.

Dans le modèle de xénogreffe tumorale MOLM-13, l'administration orale de KW-2449 pendant 14 jours montre un effet antitumoral puissant et significatif de manière dose-dépendante. [1]