NVP-BSK805 2HCl JAK 억제제

NVP-BSK805 is found to potently inhibit JAK2, whereas displaying more than 20-fold selectivity towards JAK1, JAK3, and TYK2. NVP-BSK805 causes half-maximal inhibition of full-length JAK2^V617F and JAK2 wild-type enzymes at 0.5 nM. NVP-BSK805 blocks the growth of JAK2^V617F cells (Ba/F3) and induces apoptosis with a GI50 at concentrations ＜100 nM. As constitutive STAT5 phosphorylation in dependent on JAK2, NVP-BSK805 is found to potently suppress STAT5 phophorylation at ≥ 100 nM concentrations in the JAK2 ^V617F -mutant cell lines, like MB-02. Incubation of SET-2 cells with 150 nM and 1µM of NVP-BSK805, which corresponds to concentration yielding 75% and 95% growth inhibition, respectively, for 24, 48, and 72 hours lead to concentration- and time- dependent induction of apoptosis. These results are evidenced by the detection of cleaved PARP, reduced Bcl-xL expression, and a strong increase in the number of cells with less than 2N DNA content. [1] NVP-BSK805 triggered cell death requires activation of caspase cascades and is overcome by caspase inhibition in both SET-2 and MB-02 cells. NVP-BSK805 modulates the post-translational modification of Bim and levels of Mcl-1 in JAK2^V617F cells, SET-2 and MB-02 cells. [2]

효소 분석

인간 JAK2 키나아제 도메인(아미노산 840-1132)은 플라스미드 구조체 pAcG2TtevJAK2에 포함되어 있다. JAK3(813-1124), TYK2(888-1187) 및 JAK1(866-1154)에 대한 플라스미드 구조체는 설계되었다. BD BaculoGold^TM Bright 선형화 DNA를 사용한 재조합 바큘로바이러스의 생성, 플라크 분석 및 단일 플라크로부터의 바이러스 증폭은 매뉴얼(BD Biosciences Pharmingen)에 따라 수행된다. Janus 키나아제 도메인은 27°C에서 48시간 동안 페니실린/스트렙토마이신 용액이 포함된 100 mL ExCell420 배양 배지(JRH Biosciences Ltd)가 든 400 mL 진탕 플라스크 내의 Sf9 세포에서 발현된다. 현탁 배양 세포는 1 × 10⁶의 밀도로 감염되며, 각 바이러스에 대한 감염 다중도(MOI)는 가용성 단백질 수율을 위해 최적화된다. 인간 JAK2의 키나아제 도메인과 JAK1, JAK3 및 TYK2의 키나아제 도메인은 각각 MOI 1과 0.5에서 발현된다. 27°C에서의 발현 시간은 JAK2의 경우 48시간이며, JAK1, JAK3 및 TYK2의 경우 48시간 또는 72시간이다. 감염 후 48시간 또는 72시간째에 100 mL 발현 배양액으로부터의 세포를 3000 x g에서 5분간 원심분리하여 수확하고, 12 mL 용해 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM 소듐 오르토바나데이트, 1 % Triton X-100, 10 % 글리세롤, 1 x EDTA-free complete 프로테아제 억제제 칵테일(Roche Diagnostics) 및 12.5 U/mL Benzonase)으로 4°C에서 30분간 용해시킨 후, 14,000 × g에서 45분간 원심분리하여 불용성 물질을 침전시킨다. 키나아제 도메인 단백질의 GST-태그 친화성 정제를 위한 모든 단계는 4°C에서 수행된다. 세척된 Glutathione Sepharose 4B의 50 % 슬러리 0.2 mL와 함께 정화된 용해물을 4°C에서 2시간 동안 배양한 후, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1 % Triton X-100, 1 mM DTT 및 10 % 글리세롤 1 mL로 5회 세척한다. 결합된 단백질은 0.25 mL 용출 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1 % Triton X-100, 1mM DTT, 10 % 글리세롤, 10 mM 환원형 L-글루타치온)으로 10분간 배양하는 과정을 시작으로 각각 5회 분량으로 용출된다. 용출액은 Amicon Ultra-4 스핀 컬럼을 사용하여 약 5배 농축된다. Brij35를 최종 농도 0.1 %가 되도록 첨가한 후, 단백질을 작은 분량으로 급속 냉동하여 -80 °C에서 보관한다. 이러한 조건에서 키나아제 활성은 최소 6개월 동안 안정적이다. JAK 키나아제 도메인 효소는 0.1 μM [γ³³P]-ATP, 1 mM MnCl₂, 5 mM MgCl₂, 30 μM 합성 펩타이드 기질 EQEDEPEGDYFEWLE, 1 mM DTT, 1 % DMSO, 50 μg/mL BSA, 0.01 % Brij35 및 50 mM Tris-HCl pH 7.5를 포함하는 배지에서 실온으로 30분간 배양된다. ATP 농도는 모든 단백질에 대해 Km 값 미만이다. 곡선은 XLfit®(모델 205)의 로지스틱 방정식과 전역 피팅 함수를 사용하여 비선형 회귀법으로 피팅된다. 전장 야생형 및 V617F 돌연변이 JAK2의 발현 및 특성 분석과 키나아제 분석 조건은 다른 문헌에 기술되어 있다. NVP-BSK805의 키나아제 선택성은 내부 키나아제 패널에서 평가된다. Caliper 분석에서 키나아제 반응은 인산화될 때 전기장에서 서로 다른 속도로 이동하는 펩타이드 기질을 사용하여 수행된다. 펩타이드는 모세관 시스템에서 펩타이드의 검출 및 정량을 가능하게 하기 위해 형광 표지를 부착한다. 펩타이드 형광 강도는 LC3000 장비(Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA)를 사용하여 정량화된다. 키나아제 활성은 키나아제 반응 후 용액에 남아 있는 ATP 양을 정량화하여 측정한다. LanthaScreen™ TR-FRET 키나아제 분석에서는 인산화된 기질에 대한 항체와 결합된 란타넘족 킬레이트로 테르븀이 사용된다.

Oral bioavailability of NVP-BSK805 in mice is estimated to be 45%, while it is 50% in rats. Oral administration of NVP-BSK805 at 150 mg/kg suppresses STAT5 phosphorylation, splenomegaly, and leukemic cell spreading in a Ba/F3 JAK2^V617F cell–driven mouse model. NVP-BSK805 suppresses rhEpo-induced STAT5 phosphorylation as well as rhEpo-mediated polycythemia and splenomegaly in BALB/c mice at doses of 25, 50, and 100 mg/kg orally. [1]