NVP-BSK805 2HCl JAK 억제제

NVP-BSK805는 JAK2를 강력하게 억제하는 것으로 밝혀졌으며, JAK1, JAK3 및 TYK2에 대해 20배 이상의 선택성을 보입니다. NVP-BSK805는 0.5 nM에서 전체 길이 JAK2^V617F 및 JAK2 야생형 효소의 절반 최대 억제를 유발합니다. NVP-BSK805는 JAK2^V617F 세포(Ba/F3)의 성장을 차단하고 <100 nM 농도에서 GI50으로 세포사멸을 유도합니다. 구성적 STAT5 인산화가 JAK2에 의존적이므로, NVP-BSK805는 MB-02와 같은 JAK2^V617F 돌연변이 세포주에서 ">= 100 nM 농도에서 STAT5 인산화를 강력하게 억제하는 것으로 밝혀졌습니다. SET-2 세포를 150 nM 및 1 µM의 NVP-BSK805(이는 각각 75% 및 95% 성장 억제를 유발하는 농도에 해당)와 24, 48, 72시간 동안 배양하면 농도 및 시간 의존적인 세포사멸 유도가 발생합니다. 이러한 결과는 절단된 PARP의 검출, Bcl-xL 발현 감소, 그리고 2N 미만의 DNA 함량을 가진 세포 수의 강력한 증가로 입증됩니다. [1] NVP-BSK805에 의해 유발된 세포 사멸은 카스파제 캐스케이드의 활성화를 필요로 하며, SET-2 및 MB-02 세포 모두에서 카스파제 억제에 의해 극복됩니다. NVP-BSK805는 JAK2^V617F 세포, SET-2 및 MB-02 세포에서 Bim의 번역 후 변형과 Mcl-1 수준을 조절합니다. [2]

효소 분석

인간 JAK2 키나제 도메인 (아미노산 840-1132)은 플라스미드 구조물 pAcG2TtevJAK2에 포함되어 있습니다. JAK3 (813-1124), TYK2 (888-1187) 및 JAK1 (866-1154)에 대한 플라스미드 구조물이 설계되었습니다. BD BaculoGold^TM Bright 선형화 DNA를 사용한 재조합 바큘로바이러스 생성, 플라크 분석 및 단일 플라크로부터 바이러스 증폭은 매뉴얼 (BD Biosciences Pharmingen)에 따라 수행됩니다. 야누스 키나제 도메인은 400 mL 흔들 플라스크에서 100 mL ExCell420 배양 배지 (JRH Biosciences Ltd)에 페니실린/스트렙토마이신 용액을 첨가하여 27 °C에서 48시간 동안 Sf9 세포에서 발현됩니다. 현탁 배양 세포는 1 × 10⁶의 밀도로 감염되었으며, 각 바이러스에 대한 감염 다중도 (MOI)는 가용성 단백질 수율에 최적화되었습니다. 인간 JAK2 및 JAK1, JAK3, TYK2의 키나제 도메인은 각각 1 및 0.5의 MOI로 발현됩니다. 27 °C에서의 발현 시간은 JAK2의 경우 48시간, JAK1, JAK3, TYK2의 경우 48시간 또는 72시간입니다. 감염 후 48시간 또는 72시간 후에 100 mL 발현 배양액에서 세포를 3000 x g에서 5분간 원심분리하여 수확하고, 12 mL의 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM orthovanadate 나트륨, 1 % Triton X-100, 10 % 글리세롤, 1 x EDTA-free 완전 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche Diagnostics), 그리고 12.5 U/mL Benzonase)으로 4 °C에서 30분 동안 용해한 후, 14,000 × g에서 45분 동안 원심분리하여 불용성 물질을 펠렛으로 만듭니다. 키나제 도메인 단백질의 GST-태그 친화성 정제를 위해 모든 단계는 4 °C에서 수행됩니다. 정제된 용해물은 세척된 Glutathione Sepharose 4B의 50 % 슬러리 0.2 mL와 4 °C에서 2시간 동안 배양한 후, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1 % Triton X-100, 1 mM DTT 및 10 % 글리세롤 1 mL로 5회 세척합니다. 결합된 단백질은 5개의 분취액으로 용출되며, 각 분취액은 0.25 mL의 용출 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1 % Triton X-100, 1 mM DTT, 10 % 글리세롤, 10 mM 환원형 L-글루타티온)과 10분간 배양하는 것으로 시작합니다. 용출액은 Amicon Ultra-4 스핀 컬럼으로 약 5배 농축됩니다. Brij35를 최종 농도 0.1 %로 첨가한 후, 단백질은 작은 분취액으로 급속 동결하여 -80 °C에 보관합니다. 이러한 조건에서 키나제 활성은 최소 6개월 동안 안정합니다. JAK 키나제 도메인 효소는 0.1 μM [γ³³P]-ATP, 1 mM MnCl₂, 5 mM MgCl₂, 30 μM의 합성 펩타이드 기질 EQEDEPEGDYFEWLE, 1 mM DTT, 1 % DMSO, 50 μg/mL BSA, 0.01 % Brij35 및 50 mM Tris-HCl pH 7.5를 포함하는 배지에서 실온에서 30분 동안 배양됩니다. ATP 농도는 모든 단백질의 Km보다 낮습니다. 곡선은 로지스틱 방정식과 XLfit®의 글로벌 적합 함수 (모델 205)를 사용하여 비선형 회귀로 적합화됩니다. 전체 길이 야생형 및 V617F 돌연변이 JAK2의 발현 및 특성화, 그리고 키나제 분석 조건은 다른 곳에 설명되어 있습니다. NVP-BSK805의 키나제 선택성은 내부 키나제 패널에서 평가됩니다. Caliper 분석에서 키나제 반응은 인산화될 때 전기장 내에서 다른 속도로 이동하는 펩타이드 기질로 수행됩니다. 펩타이드는 모세관 시스템에서 펩타이드의 검출 및 정량화를 가능하게 하기 위해 형광 라벨을 가지고 있습니다. 펩타이드 형광 강도는 LC3000 기기 (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA)를 사용하여 정량화됩니다. 키나제 활성은 키나제 반응 후 용액에 남아있는 ATP 양을 정량화하여 측정됩니다. LanthaScreen™ TR-FRET 키나제 분석에서 테르븀은 인산화된 기질에 대한 항체와 결합된 란타나이드 킬레이트로 사용됩니다.

NVP-BSK805의 마우스 경구 생체 이용률은 45%로 추정되며, 랫트에서는 50%입니다. 150 mg/kg의 NVP-BSK805 경구 투여는 Ba/F3 JAK2^V617F 세포 구동 마우스 모델에서 STAT5 인산화, 비장 비대 및 백혈병 세포 확산을 억제합니다. NVP-BSK805는 BALB/c 마우스에서 25, 50, 100 mg/kg 경구 투여 시 rhEpo 유도 STAT5 인산화뿐만 아니라 rhEpo 매개 다혈구증 및 비장 비대를 억제합니다. [1]