AT7519 HCl CDK 억제제

AT7519는 CDK1에 대해 38 nM의 K_i 값을 갖는 ATP 경쟁적 CDK 억제제입니다. AT7519는 GSK3β (IC50 = 89 nM)를 제외한 모든 비-CDK 키나아제에 대해 비활성입니다. AT7519는 MCF-7의 40 nM에서 SW620의 940 nM에 이르는 IC50 값을 가진 다양한 인간 종양 세포주에서 강력한 항증식 활성을 보이며, 이는 CDK1 및 CDK2 억제와 일치합니다. [1] AT7519는 48시간에 0.5~2 μM 범위의 IC50 값을 가진 다발성 골수종(MM) 세포주에서 용량 의존적 세포 독성을 유도하며, 가장 민감한 세포주는 MM.1S (0.5 μM) 및 U266 (0.5 μM)이고 가장 내성적인 세포주는 MM.1R (>2 μM)입니다. AT7519는 말초 혈액 단핵 세포(PBMNC)에서 세포 독성을 유도하지 않습니다. AT7519는 IL6 및 IGF-1에 의해 부여되는 증식 이점과 골수 기질 세포(BMSCs)의 보호 효과를 부분적으로 극복합니다. AT7519는 세린 2 및 세린 5 부위에서 RNA pol II CTD의 빠른 탈인산화를 유도하고 전사 억제를 초래하여 AT7519 유도 MM 세포의 세포 독성에 부분적으로 기여합니다. AT7519는 GSK-3β 인산화를 하향 조절하여 GSK-3β 활성화를 유도하며, 이는 또한 전사 억제와 무관하게 AT7519 유도 세포 사멸에 기여합니다. [2]

시험관 내 키나아제 분석

CDK1, CDK2 및 GSK3-β에 대한 키나아제 분석은 모두 방사성 필터 결합 형식으로 수행됩니다. CDK5에 대한 분석은 DELFIA 형식이며, CDK 4 및 6에 대한 분석은 ELISA 형식입니다. CDK1 및 2의 경우, 해당 CDK와 0.12 μg/mL 히스톤 H1은 20 mM MOPS, pH 7.2, 25 mM β-글리세로인산염, 5 mM EDTA, 15 mM MgCl₂, 1 mM 오르토바나듐산나트륨, 1 mM DTT, 0.1 mg/mL BSA, 45 μM ATP (0.78 Ci/mmol) 및 다양한 농도의 AT7519와 함께 각각 2시간 또는 4시간 동안 배양됩니다. GSK3-β의 경우, 해당 효소와 5 μM 글리코겐 합성효소 펩타이드 2와 함께 10 mM MOPS pH 7.0, 0.1 mg/mL BSA, 0.001% Brij-35, 0.5% 글리세롤, 0.2 mM EDTA, 10 mM MgCl₂, 0.01% β-메르캅토에탄올, 15 μM ATP (2.31 Ci/mmol) 및 다양한 농도의 AT7519가 3시간 동안 배양됩니다. 분석 반응은 과량의 오르토인산을 첨가하여 중단하고 Millipore MAPH 필터 플레이트를 사용하여 여과합니다. 플레이트를 세척한 후, 섬광제를 첨가하고 Packard TopCount에서 섬광 계수법으로 방사능을 측정합니다. CDK5의 경우, CDK5/p35와 1 μM의 비오틴화된 히스톤 H1 펩타이드(Biotin-PKTPKKAKKL)는 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2.5 mM MgCl₂, 0.025% Brij-35, 0.1 mg/mL BSA, 1 mM DTT, 15 μM ATP 및 다양한 농도의 AT7519와 함께 30분 동안 배양됩니다. 분석 반응은 EDTA를 사용하여 중단하고 Neutravidin 코팅 플레이트로 옮겨지며, 인산화된 펩타이드는 토끼 인산화-cdk1 기질 다클론 항체와 DELFIA 유로퓸 표지 항-토끼 IgG 이차 항체를 사용하여 λ_ex=335nm, λ_em=620nm에서 시간 분해 형광을 통해 정량됩니다. CDK 4 및 6 분석의 경우, 플레이트는 GST-pRb769-921로 코팅되고 Superblock으로 차단됩니다. CDK4 또는 6은 15 mM MgCl₂, 50 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, pH 8.0, 0.02% Triton X-100, 2.5% DMSO 및 다양한 농도의 AT7519와 함께 배양됩니다. 반응은 ATP 첨가로 시작됩니다. 30분 후, 반응은 0.5 M EDTA pH 8.0 첨가로 중단됩니다. 플레이트를 세척한 후, 1시간 동안 Superblock에 희석된 1차 항체(anti-p-Rb Serine 780)와 함께 배양하고, 이어서 1시간 동안 2차 항체(알칼리 인산가수분해효소 연결 항-토끼)와 함께 배양합니다. 플레이트는 Attophos 시스템을 사용하여 개발되고, 형광은 Spectramax Gemini 플레이트 리더에서 여기 450 nm 및 방출 580 nm에서 판독됩니다. 모든 경우에, IC50 값은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 반복 곡선에서 계산됩니다.

AT7519 (9.1 mg/kg)를 하루 두 번 투여하면 HCT116 및 HT29 대장암 이종이식 모델에서 초기 및 진행성 s.c. 종양 모두의 퇴행을 유발합니다. [1] AT7519 치료 (15 mg/kg)는 인간 MM 이종이식 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하고 마우스의 중앙 전체 생존 기간을 연장하며, 이는 증가된 카스파제 3 활성화와 관련이 있습니다. [2]