Ripasudil hydrochloride dihydrate ROCK 억제제

키나아제 억제 분석

ROCK 1 (0.75 ng/μL) 및 ROCK 2 (0.5 ng/μL)는 다양한 농도의 K-115, Y-27632 또는 HA-1077과 함께 25 °C에서 90분 동안 50 mmol/L Tris-HCl 완충액(pH 7.5)에 100 mmol/L KCl, 10 mmol/L MgCl₂, 0.1 mmol/L EGTA, 30 μmol/L Long S6 Kinase Substrate 펩타이드 및 1 μmol/L ATP를 포함하는 총 부피 40 μL로 배양됩니다. PKACα, PKC 및 CaMKIIα 또한 다양한 농도의 K-115, Y-27632 또는 HA-1077과 함께 배양됩니다. PKACα (0.0625 ng/μL)는 25 °C에서 30분 동안 40 mmol/L Tris-HCl 완충액(pH 7.5)에 20 mmol/L MgCl₂, 1 mg/mL BSA, 5 μmol/L Kemptide 펩타이드 기질 및 1 μmol/L ATP를 포함하는 총 부피 40 μL로 배양됩니다. PKC (0.025 ng/μL)는 25 °C에서 80분 동안 20 mmol/L Tris-HCl 완충액(pH 7.5)에 20 mmol/L MgCl₂, 0.4 mmol/L CaCl₂, 0.1 mg/mL BSA, 0.25 mmol/L EGTA, 25 ng/mL 포스파티딜세린, 2.5 ng/mL 디아실글리세롤, 0.0075% Triton-X-100, 25 μmol/L DTT, 10 μmol/L Neurogranin (28–43) 펩타이드 기질 및 1 μmol/L ATP를 포함하는 총 부피 40 μL로 배양됩니다. CaMKIIα (0.025 ng/μL)는 25 °C에서 90분 동안 50 mmol/L Tris-HCl 완충액(pH 7.5)에 10 mmol/L MgCl₂, 2 mmol/L CaCl₂, 0.04 mg/mL BSA, 소 고환에서 정제된 16 μg/mL 칼모듈린, 500 μmol/L DTT, 50 μmol/L Autocamitide 2 및 1 μmol/L ATP를 포함하는 총 부피 40 μL로 배양됩니다. 배양 후, 40 μL의 Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay 용액을 첨가하고 25 °C에서 10분 동안 유지한 다음, 발광계(luminometer)를 사용하여 상대 발광 단위(RLU)를 측정합니다. 시험 화합물이 없는 RLU는 100% (대조값)로 설정하고, 효소와 화합물이 없는 RLU는 0% (정상값)로 설정합니다. 그 다음, 각 농도의 시험 화합물 첨가로 인한 RLU로부터 반응 속도(% 대조군)를 계산하고, SAS를 사용하여 로지스틱 회귀 분석으로 50% 억제 농도(IC50)를 결정합니다.